腺相关病毒介导狨猴P53和P21基因沉默研究

发布时间：2017-07-03 09:17

  本文关键词：腺相关病毒介导狨猴P53和P21基因沉默研究

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【摘要】：背景P53基因和P21基因是两个重要的抑癌基因,它们参与细胞周期调控、促进细胞凋亡、帮助基因修复缺陷,与肿瘤发生与发展有重要的关系。相关功能的研究在啮齿类动物中非常多,但是由于啮齿动物在遗传学和生理学上与人类相差较大,动物模型的应用以及药物的研发上受到很大局限性。非人灵长类动物和人类有高度的亲缘性,在组织结构、免疫、生理和代谢等方面与人类高度近似,但是在非人灵长类动物上的研究受到经济条件、实验条件、伦理等制约在生物医学研究中的应用并不是十分广泛,相应的科研数据也欠全面,所以在非人灵长类动物狨猴上研究P53基因和P21基因有着重要的意义。可以有效研究基因功能与基因相互协调关系、肿瘤的生成机理、药物开发等。目的在细胞和整体动物水平,利用RNA干扰技术下调绒猴P53和P21基因表达,以期建立一种非人灵长类动物的基因调控的策略。方法(1)细胞水平：对狨猴P53和P21基因做生物信息学分析,针对靶序列设计shRNA干扰序列,构建在腺相关病毒载体上,转染非洲绿猴肾细胞(cos-7),用荧光定量PCR方法检测P53mRNA和P21mRNA抑制效果,以Westem blot方法检测p53蛋白和p2l蛋白水平表达变化。(2)动物整体水平：优选P53基因shRNA干扰序列,包装成含shRNA干扰序列的8型腺相关病毒,后肢静脉注射感染狨猴；活体荧光成像检测腺相关病毒有效感染部位和强度,四周后手术取少量肝脏组织,HE染色观察细胞是否有病理变化,用Western blot和免疫组化方法检测p53蛋白水平的变化。结果(1)细胞水平：通过生物信息学发现,腺相关病毒载体上成功构建狨猴P53基因和挖1基因RNA干扰片段若干,构建的靶点位置全部在对应基因的开放阅读框内。研究发现P21基因3个有效沉默靶点,沉默效率分别为shRNA1(65.2±8.3)％, shRNA2(66.8±8.6)%,shRNA3(71.4±7.9)％(P0.05),对应的蛋白下调shRNA 1(64.7 ±6.5)％,shRNA2(65.3±5.9)％,shRNA3(68.1±4.8)％(P0.05)；研究发现2个P53基因有效RNA干扰靶点,mRNA干扰效率分别为(82.7±8.1)%和(80.7+7.5)%(P0.05)；蛋白表达下调(77.3+11.5)%和(73.7+10.7)%(P0.05)。(2)动物整体水平：P53基因有效靶点包装成8型腺相关病毒,qPCR法测定病毒浓度达到1×1012vg/ml；2只实验组绒猴静脉注射含有P53基因干扰靶点病毒后,经活体荧光成像分析可见病毒在肝脏、睾丸、颈部等位置分布,证明病毒有效感染狨猴；四周后,手术取米粒般大小的肝脏组织,狨猴肝脏p53蛋白经Western blot和免疫组化分析未见明显变化。结论本研究在细胞水平实现绒猴P53基因和P21基因表达下调；包装的高滴度腺相关病毒能安全有效的感染狨猴部分器官,但整体动物水平狨猴肝脏p53蛋白表达未发现明显变化；今后需在感染方式、病毒剂量、蛋白检测方法等方面做进一步优化。
【关键词】：狨猴 P53 P21 RNA干扰 腺相关病毒
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;R3416
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 1 前言9-16
• 1.1 P53基因概述9-11
• 1.2 P21基因概述11-12
• 1.3 腺相关病毒概述12-13
• 1.4 狨猴概述13-14
• 1.5 该研究意义与展望14-16
• 2 材料16-20
• 2.1 质粒、细胞和实验动物16
• 2.2 主要试剂16-17
• 2.3 主要仪器和设备17-19
• 2.4 主要溶液的配置19-20
• 3. 方法20-37
• 3.1 构建含有RNA干扰片段的AAV载体20-25
• 3.2 荧光定量PCR25-28
• 3.3 Western blot28-30
• 3.4 腺相关病毒的包装30-33
• 3.5 狨猴后肢静脉注射病毒33
• 3.6 活体荧光成像33-34
• 3.7 手术取少量肝脏组织34
• 3.8 冰冻切片免疫荧光34-35
• 3.9 石蜡切片免疫组化35-36
• 3.10 肝脏组织Western Blotting36-37
• 4 实验结果37-48
• 4.1 腺相关病毒干扰载体构建37-39
• 4.2 细胞水平沉默效率的验证39-42
• 4.3 病毒包装42-43
• 4.4 病毒感染狨猴43-44
• 4.5 活体荧光成像44-45
• 4.6 肝脏组织P53基因沉默效率检测45-48
• 讨论48-51
• 总结51-52
• 参考文献52-56
• 缩略词56-58
• 个人信息58-59
• 致谢59-60

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本文编号：513104