单核细胞增生李斯特菌p60蛋白结构域功能鉴定及其底物结合特性研究

发布时间：2017-07-04 05:05

  本文关键词：单核细胞增生李斯特菌p60蛋白结构域功能鉴定及其底物结合特性研究

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【摘要】：单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)是一种典型的人兽共患病食源性病原菌,在自然界中普遍存在。由于其具有感染人类和多种动物而导致严重李斯特菌病的特性,该菌已引起了广泛关注。p60蛋白为该病原菌产生的一种胞外蛋白,与李斯特菌的致病性密切相关。现有的研究结果表明p60蛋白在Lm发病机理中的主要作用与细胞分裂、宿主细胞入侵、细菌细胞表面结构的维持及免疫活性细胞壁成分的释放有关。因此,p60蛋白也被称为侵染辅助蛋白(invasion-associated protein, Iap)。p60蛋白的三级结构预测结果显示：若在270位氨基酸附近将p60蛋白切开,可以获得两个能够彼此独立存在的结构域(N端结构域和C端结构域)。同时,氨基酸序列分析显示：p60蛋白的N端不仅含有两个LysM结构域的氨基酸基序,其间还存在着一个SH3结构域的氨基酸基序,而p60蛋白的C端只含有一个NlpC/P60家族结构域的氨基酸基序。但到目前为止,这些结构域在p60蛋白中的确切功能还不清楚。本研究表达和纯化了全长p60蛋白、LysM1结构域、LysM2结构域、SH3结构域、C端结构域、LysM1-SH3结构域共存体以及LysM1结构域缺失体共七种重组蛋白。本研究利用Insoluble Pulldown法鉴定出p60蛋白的N端结构域行使结合功能,且LysM1、SH3、LysM2结构域均具有结合活性但LysM1的活性较弱,而p60蛋白的C端结构域则完全不具有结合活性。随后,本研究利用复性SDS-PAGE法鉴定出p60蛋白的C端结构域行使裂解功能。此外,本研究发现LysM1-SH3结构域共存体的结合活性不单单是LysM1与SH3结构域结合活性的简单相加,这表明LysM1与SH3结构域之间可能存在着协同结合底物的作用。最后,本研究综合运用Insoluble Pulldown法和比浊法测定了LysM1结构域缺失体的结合活性和裂解活性,实验结果表明：虽然LysM1结构域的缺失只导致p60蛋白整体的结合活性下降约10%,但会使p60蛋白整体裂解活性的降幅达到70%。已有研究显示：p60蛋白具有裂解细菌细胞壁的活性,其对细胞壁的裂解可以帮助Lm逃避宿主的先天免疫系统,而使其能在宿主细胞中存活和繁殖,导致宿主出现严重的李斯特菌病。而p60蛋白与底物的识别与结合是其发挥裂解活性的首要前提,因此对p60蛋白的底物结合特性进行全面研究也是本研究的一项重要工作。本研究确定了p60蛋白不是金属蛋白且该蛋白内不含有二硫键。当温度为36℃,pH值为7.5时,p60蛋白的结合活性达到最大,且其活性能被10mM的Na+、K+、和Ca2+分别提高11%、15%以及21%。本研究还发现,p60蛋白作为一种细菌LysM蛋白并不区分GlcNAc-MurNAc与GlcNAc多聚物。本研究也得出了N-乙酰葡糖胺C2’位置上的酰胺基在结合反应中是至关重要的结论。最后,分子筛层析实验结果表明p60蛋白在缓冲液中是以单体的形式存在。
【关键词】：单核细胞增生李斯特菌 p60蛋白 结构域功能 LysM结构域 底物识别结合
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61;R378
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-9
• 缩略语与符号语说明9-10
• 第一章 文献综述10-23
• 1.1 单核细胞增生李斯特菌概况10-14
• 1.1.1 李斯特菌分型10-11
• 1.1.2 单核细胞增生李斯特菌的生物学特性11
• 1.1.3 单核细胞增生李斯特菌的致病机制11-12
• 1.1.4 单核细胞增生李斯特菌的主要毒力因子12-14
• 1.2 p60蛋白是一种与单核细胞增生李斯特菌有关的侵染辅助蛋白14-15
• 1.3 p60蛋白具有水解肽聚糖的活性15-16
• 1.4 p60蛋白含有LysM结构域、SH3结构域和NlpC/P60家族结构域16-21
• 1.4.1 LysM结构域概述16-18
• 1.4.2 SH3结构域概述18-19
• 1.4.3 NlpC/P60家族结构域概述19-21
• 1.5 研究意义21-23
• 第二章 材料与方法23-39
• 2.1 实验材料23-25
• 2.1.1 菌株、质粒与引物23-24
• 2.1.2 试剂与材料24-25
• 2.1.3 主要仪器25
• 2.2 溶液配制25-27
• 2.3 实验方法27-39
• 2.3.1 全长p60蛋白重组表达质粒pR60的构建27-30
• 2.3.1.1 扩增模板的制备27
• 2.3.1.2 PCR扩增目的基因片段27
• 2.3.1.3 PCR产物回收27-28
• 2.3.1.4 目的基因片段与表达载体的酶切28-29
• 2.3.1.5 目的基因片段与表达载体的连接29
• 2.3.1.6 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞29
• 2.3.1.7 细菌培养29
• 2.3.1.8 质粒抽提29-30
• 2.3.1.9 酶切筛选阳性克隆及测序鉴定30
• 2.3.2 p60蛋白结构域缺失体重组表达质粒的构建30-31
• 2.3.2.1 LysM1结构域缺失体重组表达质粒的构建30-31
• 2.3.2.2 N端结构域缺失体重组表达质粒的构建31
• 2.3.3 p60蛋白N端各结构域重组表达质粒的构建31-33
• 2.3.3.1 LysM1结构域重组表达质粒的构建31
• 2.3.3.2 LysM2结构域重组表达质粒的构建31
• 2.3.3.3 LysM1-SH3结构域共存体重组表达质粒的构建31
• 2.3.3.4 SH3结构域重组表达质粒的构建31-33
• 2.3.4 各重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达33-35
• 2.3.4.1 小量试表达蛋白样品准备33
• 2.3.4.2 小量试表达蛋白样品处理33
• 2.3.4.3 SDS—PAGE凝胶电泳检测蛋白是否表达33-34
• 2.3.4.4 目的蛋白的大量诱导表达与镍亲和层析柱纯化34
• 2.3.4.5 Ni~(2+)-NTA agarose再生34-35
• 2.3.4.6 目的蛋白的透析35
• 2.3.4.7 目的蛋白超滤浓缩与浓度测定35
• 2.3.5 枯草芽孢杆菌细胞壁的提取与纯化35-36
• 2.3.6 从单核细胞增生细胞李斯特菌中提取蛋白质36
• 2.3.7 利用底物Insoluble Pulldown法鉴定蛋白结合活性36
• 2.3.8 利用比浊法与复性SDS-PAGE法鉴定蛋白裂解活性36-37
• 2.3.8.1 比浊法36-37
• 2.3.8.2 复性SDS-PAGE法37
• 2.3.9 p60蛋白最适结合条件的确定37-38
• 2.3.9.1 不同温度对p60蛋白结合活性的影响37
• 2.3.9.2 不同pH对p60蛋白结合活性的影响37
• 2.3.9.3 不同金属离子与化学组分对p60蛋白结合活性的影响37-38
• 2.3.10 p60蛋白底物结合特异性38
• 2.3.11 利用分子筛层析鉴定p60蛋白在溶液中的低聚状态38-39
• 第三章 实验结果39-59
• 3.1 重组表达质粒的构建与鉴定39-42
• 3.2 重组表达质粒的原核表达与纯化42-45
• 3.2.1 p60蛋白及其LysM1结构域缺失体的表达与镍亲和层析柱纯化42
• 3.2.2 p60蛋白C端结构域的表达与镍亲和层析柱纯化42-43
• 3.2.3 p60蛋白LysM1结构域及LysM2结构域的表达与镍亲和层析柱纯化43-44
• 3.2.4 p60蛋白SH3结构域及LysMl-SH3共存体的表达与镍亲和层析柱纯化44-45
• 3.2.5 各重组蛋白的透析与浓缩45
• 3.3 p60蛋白N端结构域和C端结构域功能的鉴定45-49
• 3.4 p60蛋白N端两种LysM结构域的生物信息学分析49-51
• 3.5 探究LysM1结构域在整个p60蛋白中的功能意义51-53
• 3.6 p60蛋白最适结合条件的确定53-56
• 3.6.1 不同温度对p60蛋白结合活性的影响53-54
• 3.6.2 不同pH对p60蛋白结合活性的影响54-55
• 3.6.3 不同金属离子与化学组分对p60蛋白结合活性的影响55-56
• 3.7 p60蛋白底物结合特异性56-57
• 3.8 利用分子筛层析鉴定p60蛋白在溶液中的低聚物状态57-59
• 第四章 讨论59-63
• 参考文献63-74
• 致谢74-75
• 攻读学位期间发表的学术论文75-76

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