结核分枝杆菌Rv0220、Rv2958c、Rv2994和Rv3347c的免疫活性及其诊断价值的研究

发布时间：2017-07-04 05:11

  本文关键词：结核分枝杆菌Rv0220、Rv2958c、Rv2994和Rv3347c的免疫活性及其诊断价值的研究

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【摘要】：[目的]构建含结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)Rv0220、Rv2958c、Rv2994和Rv3347c基因的原核表达载体,表达并纯化其重组蛋白,检测各蛋白的免疫活性,并评估其在结核病血清学诊断中的应用价值。[方法](1)以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板,PCR分别扩增Rv0220、Rv2958c、Rv2994和Rv3347c基因,将其分别亚克隆到p ET-28a以构建成p ET-28a/Rv0220、p ET-28a/Rv2958c、p ET-28a/Rv2994和p ET-28a/Rv3347c重组载体,经测序鉴定后,将其分别转化到大肠杆菌,优化表达条件后大量表达各重组蛋白,经Ni-NTA柱亲和层析法纯化各重组蛋白并经透析复性。Western blot鉴定各重组蛋白的抗原性。BCA法测定各重组蛋白的浓度。(2)分别将纯化并鉴定后的各重组蛋白经皮下多点注射免疫雌BALB/c小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体水平;流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞培养上清液中IL-4、IL-10、IL-2和IFN-γ的浓度,CCK8法检测小鼠脾淋巴细胞刺激指数。(3)间接ELISA法分别检测rRv0220、rRv2958c、rRv2994和rRv3347c与临床结核病患者血清、阴性血清及肺炎支原体阳性血清的反应情况,各份临床血清经结核胶体金法试剂盒(38KDa-16KDa抗原)检测。评估各重组蛋白在结核病血清学诊断中的价值。[结果](1)成功构建了四种原核表达重组载体p ET-28a/Rv0220、p ET-28a/Rv2958c、p ET-28a/Rv2994和p ET-28a/Rv3347c,四种重组载体均以包涵体状态表达。(2)rRv0220、rRv2958c、rRv2994和rRv3347c均具有良好的免疫原性,能诱导小鼠产生特异性抗体。小鼠血清中特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a水平随免疫次数增加呈上升趋势。末次免疫小鼠两周后,各免疫组小鼠血清抗体Ig G、Ig G1和Ig G2a的均产生较高的抗体效价均在1:6400以上。(3)rRv0220、rRv2958c、rRv2994和rRv3347c均能诱导小鼠产生较强的细胞免疫应答。末次免疫后两周,各免疫组小鼠脾淋巴细胞刺激指数SI值均明显高于对照组(P0.01)。与对照组相比,各免疫组小鼠脾淋巴细胞均能产生较高水平的IL-4、IL-10、IL-2和IFN-γ(P0.01)。(4)经Western blot检测,rRv0220、rRv2958c、rRv2994和rRv3347c均能与结核病患者血清发生特异性反应。间接ELISA结果表明:与结核胶体金法比较,测得rRv0220的特异度为98.6%,敏感度为98.3%,总符合率均为98.4%;rRv2985c的特异度为100.0%,敏感度为96.5%,总符合率为98.4%;rRv2994的特异度为96.5%,敏感度为100.0%,总符合率为98.4%;rRv3347c的特异度为94.7%,敏感度为98.6%,总符合率为96.9%[结论](1)成功构建了四种原核表达载体p ET-28a/Rv0220、p ET-28a/Rv2958c、p ET-28a/Rv2994和p ET-28a/Rv3347c,表达并纯化了其相应的重组蛋白。(2)rRv0220、rRv2958c、rRv2994和rRv3347c均具有有良好的免疫原性,能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫应答,且以Th1型细胞免疫反应为主。(3)rRv0220、rRv2958c、rRv2994和rRv3347c均能与结核病患者血清发生特异结合,具有良好免疫反应性。
【关键词】：结核分枝杆菌 结核病 重组蛋白 免疫活性 血清学诊断
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-10
• 常用的英文缩写10-14
• 第1章 绪论14-18
• 第2章 实验材料18-22
• 2.1 主要实验器材18
• 2.2 菌株、质粒与试剂18-22
• 第3章 实验方法步骤22-36
• 3.1 原核重组载体的构建及鉴定22-26
• 3.2 四种重组蛋白的表达、纯化与鉴定26-29
• 3.3 重组蛋白的免疫活性研究29-33
• 3.4 重组蛋白免疫反应性的临床评价33-34
• 3.5 统计学方法34-36
• 第4章 实验结果36-48
• 4.1 四种原核表达载体的构建及鉴定36-37
• 4.2 四种重组质粒的表达与纯化37-39
• 4.3 四种重组蛋白的免疫活性评价39-45
• 4.4 四种重组蛋白的临床血清学检测45-48
• 第5章 讨论48-52
• 第6章 结论52-54
• 参考文献54-58
• 附录58-64
• 文献综述64-74
• 参考文献70-74
• 课题资助74-76
• 研究成果及论文76-78
• 致谢78

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本文编号：516451