表达HBsAg重组痘苗病毒小鼠免疫效果初步研究

发布时间：2017-07-14 01:13

  本文关键词：表达HBsAg重组痘苗病毒小鼠免疫效果初步研究

  更多相关文章： 痘苗病毒安卡拉株 乙型肝炎病毒 痘病毒载体 疫苗

【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染可造成急性或慢性肝脏疾病,根据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)报告,全球现有2.4亿多慢性肝脏感染疾病患者,急性或慢性乙肝可导致每年78万多人死亡,乙肝是全球最突出的公共卫生问题之一。目前使用的慢性乙肝治疗药物主要有IFN、PEG-IFN-a以及核酸类似物等药物。药物治疗只能延缓乙肝患者肝硬化进展、降低肝癌发生率以及延长生存期,不能彻底清除患者体内病毒,并且药物治疗存在副作用、耐药、长期口服药物患者依从性差等缺点。HBV持续感染时,持续高病毒量、高HBeAg可导致T细胞耗竭、免疫反应受损,因而提出治疗型疫苗概念,通过诱导机体产生特异性细胞免疫,打破免疫耐受状态,从而清除病毒。病毒载体疫苗是乙肝治疗型疫苗研究热点方向之一。由于修饰的痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia Ankara, M VA)的外源基因容量大、复制缺陷、安全性高,使其成为重组病毒疫苗的理想载体。本实验通过基因克隆技术,构建含有HBsAg基因的重组质粒pSC11-S。将pSC11-S质粒转染已感染MVA病毒的BHK-21细胞,质粒和病毒基因组之间发生同源重组,通过数轮蓝白斑筛选和PCR鉴定目的基因,获得携带HBsAg基因的重组病毒MVA-S, Western Blot实验结果显示重组病毒MVA-S表达乙肝表面抗原。采用不同的免疫策略,使用MVA-S和DNA-S疫苗免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞,经特异性激肽刺激小鼠脾细胞分泌IFN-γ,通过ELISpot实验检测特异性细胞免疫应答,比较各个实验组的ELISpot结果,分析不同免疫策略产生的免疫效果。首先,用MVA-S和同样表达HBsAg的两种DNA疫苗(pVR-S、pcDNA-S)分别单独免疫BALB/c小鼠,统计分析三个实验组与相应对照组的ELISpot斑点形成细胞(Spot-forming Cells,SFC)的差异具有统计学意义,三个实验组之间的ELISpot结果无统计学差异(F=0.61,P=0.5599),表明MVA-S、pVR-S和pcDNA-S均能刺激小鼠产生特异性细胞免疫应答,但它们相互之间无差异。其次,探讨了异源联合免疫效果。实验组小鼠采用DNA疫苗初始免疫、重组病毒MVA-S加强免疫,对照组小鼠DNA疫苗初始免疫后,使用MVA病毒加强免疫。结果显示,实验组和对照组的SFC差异具有统计学意义(P0.05),异源联合免疫组SFC高于DNA单独免疫组,证实了异源联合免疫可引起更强的免疫效果。本实验采用联合免疫策略,设置了三个不同剂量的重组病毒MVA-S进行加强免疫,分别为低、中、高剂量组。在2次DNA疫苗初始免疫后,使用不同剂量MVA-S免疫小鼠,结果显示,不同剂量组之间ELISpot结果具有统计学差异(F=12.67,P=0.0036),高剂量组SFC最高,表明在本实验剂量组范围内,高剂量MVA-S加强免疫可获得更高的细胞免疫应答反应。实验中还探究了不同DNA载体疫苗对免疫效果的影响。分别以pVR-S、 pcDNA-S两种DNA疫苗初始免疫小鼠,采用相同MVA-S加强免疫,结果显示联合免疫中两种DNA疫苗免疫效果无统计学差异,表明不同的DNA载体不会影响加强免疫效果。
【关键词】：痘苗病毒安卡拉株 乙型肝炎病毒 痘病毒载体 疫苗
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 英文缩略词表11-12
• 前言12-16
• 一、重组质粒的构建和鉴定16-22
• 1. 材料及仪器设备16-18
• 1.1 质粒16
• 1.2 引物16
• 1.3 主要试剂16
• 1.4 主要仪器16-18
• 2. 方法18-21
• 2.1 PCR扩增目的片段18
• 2.2 PCR产物回收(胶回收试剂盒)18-19
• 2.3 目的片段酶切和连接19
• 2.4 连接产物在E.coli DH5α感受态细胞中转化19
• 2.5 单克隆菌培养19
• 2.6 提取质粒(质粒小量提取试剂盒)19-20
• 2.7 重组质粒鉴定20-21
• 3. 结果21-22
• 3.1 PCR扩增目的片段21
• 3.2 重组质粒pSC11-S的鉴定21-22
• 二、表达HBsAg基因的重组MVA构建和鉴定22-30
• 1. 材料及仪器设备22-24
• 1.1 病毒、细胞和鸡胚22
• 1.2 引物22
• 1.3 试剂22-23
• 1.4 主要仪器与耗材23-24
• 2. 方法24-28
• 2.1 重组MVA构建24
• 2.2 鸡胚成纤维细胞(Chick Embryo Fibroblast, CEF)制备24
• 2.3 重组病毒单个蓝斑筛选24-25
• 2.4 重组病毒鉴定25-28
• 2.4.1 病毒DNA提取25-26
• 2.4.2 PCR扩增26
• 2.4.3 Western Blot鉴定HBsAg表达26-28
• 3. 结果28-30
• 3.1 重组MVA-S筛选28
• 3.2 重组病毒MVA-S鉴定28-30
• 3.2.1 PCR鉴定28-29
• 3.2.2 Western Blot鉴定29-30
• 三、重组病毒MVA-S在小鼠体内的免疫30-43
• 1. 材料30-32
• 1.1 小鼠免疫物30
• 1.2 主要试剂30-31
• 1.3 刺激肽序列31
• 1.4 主要仪器及耗材31
• 1.5 实验小鼠31-32
• 2. 方法32-39
• 2.1 免疫物准备32-35
• 2.2 小鼠免疫方案35-37
• 2.3 ELISpot检测细胞免疫应答水平37-38
• 2.4 统计分析38-39
• 3. 结果39-43
• 3.1 病毒滴度测定结果39
• 3.2 ELISpot检测特异性细胞免疫应答水平39-43
• 讨论43-45
• 总结45-47
• 结论47-48
• 参考文献48-50
• 附录50-65
• 文献综述65-78
• 参考文献74-78
• 作者简介78-79
• 致谢79

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本文编号：539097