鹦鹉热衣原体质粒蛋白CPSIT_p8抗感染免疫保护作用

发布时间：2017-07-15 20:10

  本文关键词：鹦鹉热衣原体质粒蛋白CPSIT_p8抗感染免疫保护作用

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【摘要】：目的:探究鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci,Cps)质粒蛋白CPSIT_p8抗感染保护作用,为研制抗Cps感染的亚单位疫苗奠定基础。方法:从Gen Bank中获取CPSIT_p8基因的完整序列,设计特异性引物。以菌株Cps 6BC基因组DNA为模板,经PCR扩增构建pET-30a-CPSIT_p8原核重组表达载体,最后转化至宿主菌E.coli BL21中,经IPTG诱导表达、Ni-NTA亲和层析法纯化,收集重组蛋白,BCA法测定蛋白浓度,采用Western blotting分析和鉴定。经腹腔途径将CPSIT_p8重组蛋白免疫雌性BALB/c小鼠,采用间接ELISA法检测免疫小鼠血清中重组蛋白多克隆抗体的效价。以制备的多克隆抗体为一抗,运用间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay,IFA)分析CPSIT_p8质粒蛋白在感染细胞中的定位情况。小鼠末次免疫2周后,取脾细胞进行培养,ELISA双抗体夹心法检测小鼠脾细胞培养上清中的IL-4、IFN-γ细胞因子水平;同时,经5.0×105 IFUs Cps6BC呼吸道感染BALB/c小鼠,观察小鼠发病情况、体重、生存率等一般指标的动态变化;在感染10天后,处死小鼠,取肺组织进行培养,计数各组衣原体包涵体滴度;并采用ELISA法检测肺组织匀浆上清中细胞因子水平;取肺组织进行HE染色和S-P免疫组织化学染色,比较CPSIT_p8蛋白免疫组与对照组小鼠肺组织的病变程度;以评估CPSIT_p8蛋白免疫保护作用。同时,进行小鼠体内中和试验和Cps的体外中和试验,于感染10天后,取肺组织进行培养,计数各组衣原体包涵体滴度;以评估小鼠血清中CPSIT_p8特异性抗体的中和能力。结果:1.构建的原核重组表达载体pET-30a-CPSIT_p8,经PCR和测序鉴定,测序结果与Genbank上登录序列完全一样;SDS-PAGE分析表明,在IPTG诱导下,CPSIT_p8重组蛋白在菌体内能以可溶性状态表达,且该蛋白相对分子量(Mr)与预测的分子量相近。表达产物采用Ni-NTA亲和层析法纯化后,经Western blotting鉴定,证实该重组蛋白的存在。2.将重组蛋白经腹腔途径免疫三次6~8周的雌性BALB/c小鼠后,小鼠血清中总Ig G抗体效价高达1:1024000。3.在Cps感染He La细胞36h后,采用IFA法分析CPSIT_p8质粒蛋白在感染细胞中的定位,通过激光共聚焦显微镜观察到CPSIT_p8质粒蛋白定位于包涵体内。4.ELISA法检测各组小鼠脾细胞上清中的细胞因子,结果表明CPSIT_p8蛋白免疫组(1734.54±21.48pg/m L)IFN-γ含量明显高于佐剂组(195.35±3.22pg/m L)和PBS组(168.91±17.74pg/m L)(P0.001);而各组IL-4水平都很低(P0.05)。5.CPSIT_p8蛋白免疫组小鼠经Cps呼吸道鼻滴感染10d后,取肺组织进行培养,包涵体数量低于对照组(P0.05),ELISA法检测肺组织匀浆上清中细胞因子水平,CPSIT_p8蛋白免疫组的IFN-γ水平明显低于对照组(P0.001),肺组织经HE染色和S-P免疫组织化学染色,观察分析CPSIT_p8蛋白免疫组肺部组织病理改变明显比对照组轻;同时,免疫组织化学染色肺组织,结果显示免疫组衣原体棕黄色颗粒明显比对照组少。6.小鼠体内中和试验和Cps的体外中和试验,经Cps呼吸道感染10天后,取肺组织进行培养,结果显示,CPSIT_p8蛋白免疫组和对照组包涵体数量无统计学差异(P0.05)。结论:CPSIT_p8重组蛋白可诱导BALB/c小鼠产生高水平的Th1型细胞免疫应答,对BALB/c小鼠抗Cps感染具有良好的免疫保护作用。
【关键词】：鹦鹉热衣原体 CPSIT_p8 质粒蛋白 免疫应答 免疫保护作用
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 主要缩略词对照索引13-15
• 第1章 前言15-19
• 第2章 实验材料19-23
• 2.1 主要仪器设备19-20
• 2.2 菌株和细胞株20
• 2.3 主要试剂20-23
• 第3章 实验方法23-39
• 3.1 原核表达载体pET-30a/CPSIT_p8的构建及鉴定23-27
• 3.2 CPSIT_p8重组蛋白在E. coli BL21中的诱导表达及鉴定27-29
• 3.3 CPSIT_p8重组蛋白免疫原性的检测29-30
• 3.4 IFA法分析目的蛋白在感染细胞中的定位30-32
• 3.5 CPSIT_p8蛋白的免疫保护作用32-37
• 3.6 小鼠体内中和试验和Cps的体外中和试验37
• 3.7 统计学处理方法37-39
• 第4章 实验结果39-51
• 4.1 目的基因PCR扩增39
• 4.2 pET-30a/CPSIT_p8重组载体的菌液PCR鉴定39-40
• 4.3 重组菌序列Blast分析40-42
• 4.4 pET-30a/CPSIT_p8重组质粒在E. coli BL21的诱导表达42
• 4.5 CPSIT_p8重组蛋白的纯化42-43
• 4.6 CPSIT_p8重组蛋白的Western blotting分析43
• 4.7 免疫小鼠血清的特异性抗体水平分析43-44
• 4.8 CPSIT_p8蛋白在感染细胞内的定位44-45
• 4.9 CPSIT_p8重组蛋白免疫保护作用45-48
• 4.10 小鼠体内中和试验和Cps的体外中和试验48-51
• 第5章 讨论51-55
• 第6章 结论55-57
• 参考文献57-63
• 文献综述63-75
• 参考文献70-75
• 作者攻读学位期间的科研成果75-76
• 资助基金项目76-77
• 致谢77

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1 梁明星;鹦鹉热衣原体质粒蛋白CPSIT_p8抗感染免疫保护作用[D];南华大学;2016年

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本文编号：545540