E3泛素连接酶NEDD4L在抗病毒固有免疫应答中的调控及机制研究

发布时间：2017-08-01 07:53

  本文关键词：E3泛素连接酶NEDD4L在抗病毒固有免疫应答中的调控及机制研究

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【摘要】：固有免疫应答是机体防御病原入侵的第一道防线。固有免疫细胞如巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cells,DCs)等抗原提呈细胞通过其表面模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)检测微生物分子成分—病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),PRRs也能够识别来源于损伤组织和坏死细胞的免疫刺激产物,也称作(damage-associated molecular patterns,DAMPs)。这种识别对于机体防御至关重要。病毒感染时能够诱导机体产生Ⅰ型干扰素,这一过程依赖于免疫细胞的PRRs对病毒成分的识别。TLRs(Toll-like receptors)识别相应PAMPs后,能够活化一系列胞内信号分子,最终导致依赖于核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的促炎细胞因子的产生以及依赖于干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRF)的Ⅰ型干扰素产生。维甲酸诱导的基因I样受体(retinoic acid-inducible gene I-like receptors,RLRs)是存在于细胞质中的一类RNA解旋酶,主要负责ds RNA病毒的识别。RLRs包括RIG-I(retinoic acid-inducible gene I)和MDA5(melanoma differentiation-associated protein 5),通过与病毒的相互作用促进IRF的活化与核转位,诱导Ⅰ型干扰素的产生。水泡口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)能够活化TLRs和RLRs。Ⅰ型干扰素可促进200多种抗病毒基因的转录,在病毒感染的多个阶段发挥干预作用,并且能够提高细胞毒NK细胞和CD8+T细胞对感染细胞的敏感性,抵御病毒感染。泛素化(ubiquitination)是一种普遍存在的蛋白质转录后修饰方式,可涉及众多生物学过程。信号蛋白的泛素化修饰在固有免疫应答中至关重要,因为它能够调控信号蛋白的活性与功能。泛素化修饰作为一个关键的调节机制,参与固有免疫应答中病原微生物的识别与清除和适应性免疫应答中的抗原提呈与激活。泛素化是一个涉及3种酶的级联反应:E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶(E3 ubiquitin protein ligases,E3s)。泛素化过程对底物的特异性识别主要依赖于E3s,E3s具有庞大的家族,经人类基因组学分析,已发现700余种E3s。E3s主要分为两类:HECT(homologous to the E6-AP C terminus)E3s和RING(really interesting new gene)E3s。E3s参与免疫应答众多信号通路的调节,例如,E3泛素连接酶RNF125对RIG-I进行K48泛素化修饰介导RIG-I在蛋白酶体的降解,负向调控RIG-I信号通路;A20作为一个去泛素化的E3泛素连接酶,在病毒感染过程中可以靶向调节NF-κB和IRF信号通路。NEDD4L(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated 4-like)是E3泛素连接酶NEDD4家族成员,属于HECT E3s。NEDD4家族具有独特的分子结构特点:N-末端C2结构域(amino terminal Ca2+phospholipid binding domain)、C-末端的HECT结构域和位于二者之间的2-4个中心WW结构域(protein protein interaction domains)。WW结构域的不同是区分各个成员的主要标志,并涉及成员间不同的生物学功能。NEDD4L最初是在早期胚胎神经系统中作为一个发育下调基因被发现的,NEDD4L广泛高表达于肝、肾、心、肺等器官。已有报道NEDD4L能够泛素化修饰上皮细胞钠离子通道,是机体维持正常血压的关键调控者,NEDD4L的突变与高血压等心血管疾病的发生密切相关;NEDD4L与许多肿瘤相关:在结肠癌中,NEDD4L可抑制经典的Wnt信号通路发挥抑癌作用;可泛素化降解,负向调控信号通路。也涉及到病毒如1的出芽过程。然而,到目前为止,尚未有NEDD4L在固有免疫应答中的相关报道。已知NEDD4家族中的NEDD4、ITCH能够通过不同的方式调节免疫细胞的功能和固有免疫应答。NEDD4L作为一个与NEDD4高度同源,且表达广泛的E3泛素连接酶,是否参与抗病毒固有免疫应答的调控尚不清楚。本课题分三部分对NEDD4L在抗病毒固有免疫应答中的调控以及其作用机制进行了研究。一、NEDD4L对VSV诱导Ⅰ型干扰素产生的选择性促进作用在C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞中,我们发现VSV感染能够上调NEDD4L的表达水平且具有时间依赖性。利用靶向干扰NEDD4L的si RNA抑制NEDD4L在巨噬细胞中的表达,发现NEDD4L的敲减能够抑制VSV诱导的IFN-β的产生,而对TNF-α、IL-6的产生无明显影响。通过将NEDD4L条件性敲除(CKO)小鼠和Lyz2cre小鼠杂交,培育出NEDD4L髓系基因敲除小鼠(NEDD4Lfl/fl Lyz2cre+)和同窝野生型对照小鼠(NEDD4Lfl/fl Lyz2cre-)。经免疫印迹分析NEDD4L的敲除效率,发现在小鼠腹腔巨噬细胞中NEDD4L的表达水平降低70%以上,在骨髓巨噬细胞中NEDD4L表达量降低80%以上。我们观察到NEDD4L的缺失不影响小鼠的生长发育,并且经流式细胞术分析了小鼠脾脏、骨髓、外周血中免疫细胞种类与数量,发现NEDD4L的敲除并不影响小鼠免疫细胞的分化发育。在体外利用VSV感染NEDD4Lfl/fl Lyz2cre-和NEDD4Lfl/fl Lyz2cre+小鼠的腹腔巨噬细胞,发现NEDD4L的缺失显著抑制了VSV诱导的IFN-β的产生,而促炎细胞因子TNF-α、IL-6的产生无明显差异。以上研究结果说明VSV感染时,NEDD4L能够促进Ⅰ型干扰素的产生,但不影响促炎细胞因子的生成。二、NEDD4L调控Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究根据第一部分得到的结果,我们首先检测了NEDD4L对VSV感染所活化的信号通路的影响。在不同时间点利用VSV感染NEDD4Lfl/fl Lyz2cre-和NEDD4Lfl/fl Lyz2cre+小鼠巨噬细胞,通过免疫印迹发现NEDD4L的缺失显著抑制了TBK1和IRF3的活化,但不影响MAPKs中JNK、ERK和P38以及NF-κB中P65的活化,提示NEDD4L作用于TBK1的上游,促进下游信号的活化。我们进一步研究了NEDD4L作用的分子机制。在病毒感染激活的信号通路中,泛素连接酶TRAF3位于TBK1的上游,可发生泛素化修饰调控RLRs、TLRs信号,是调节Ⅰ型干扰素产生的关键信号蛋白。通过分析NEDD4L的氨基酸序列发现NEDD4L具有多个TRAF结合位点。因此我们猜测,NEDD4L或许是通过与TRAF3相互作用促进了下游信号分子TBK1和IRF3的活化。为了进一步验证,我们利用VSV感染小鼠腹腔巨噬细胞以激活NEDD4L参与的信号通路,通过免疫共沉淀实验确定NEDD4L能够与TRAF3相互结合。为了进一步寻找NEDD4L与TRAF3相互结合的结构域,我们根据NEDD4L分子结构特点构建了其不同结构域缺失的突变体:分别为N-末端C2结构域缺失突变体(NEDD4L-δC2),C-末端HECT结构域缺失突变体(NEDD4L-δHECT),C2及WW结构域缺失突变体(NEDD4L-δCW)以及位于HECT结构域中的943位半胱氨酸残基突变体(NEDD4L-C943A)。我们将NEDD4L及其不同突变体的表达质粒与TRAF3共转染于HEK293T细胞,经免疫共沉淀发现C2及WW结构域的缺失(NEDD4L-δCW)会阻碍NEDD4L与TRAF3的结合,而C2结构域的缺失(NEDD4L-δC2)并不影响其与TRAF3的结合,说明WW结构域是二者相互结合的必要结构域。我们继而检测了二者的相互作用方式。NEDD4L作为E3泛素连接酶,能够特异性识别底物并对其进行泛素化修饰发挥功能。TRAF3能够发生泛素化修饰参与信号强弱的调控。因此,我们首先检测了NEDD4L对TRAF3泛素化水平的影响。我们在HEK293T细胞中共转染NEDD4L、TRAF3和泛素(Ubiquitin,Ub)的表达质粒,发现NEDD4L可明显促进TRAF3的泛素化。我们进一步寻找了NEDD4L对TRAF3泛素化修饰的必要功能域,通过免疫共沉淀实验发现,HECT结构域缺失(NEDD4L-δHECT)显著抑制了NEDD4L对TRAF3的泛素化,说明NEDD4L是通过HECT结构域泛素化修饰TRAF3。C2结构域缺失(NEDD4L-δC2)显著促进了TRAF3的泛素化,提示C2结构域在功能上属于自我抑制基序。随后,我们利用Ub及其K63、K48、K29、K11位赖氨酸残基突变的质粒与TRAF3、NEDD4L共转染,以明确NEDD4L对TRAF3的泛素化方式,发现K29赖氨酸残基突变体(Ub-K29R)显著抑制了NEDD4L对TARF3的泛素化,说明NEDD4L对TRAF3的修饰为K29泛素化修饰。第二部分结果说明,NEDD4L通过其WW结构域与TRAF3相互结合,通过HECT结构域对TRAF3进行K29泛素化修饰,增强了下游信号分子IRF3的活化,促进Ⅰ型干扰素的产生,并且,C2结构域在功能上属于自我抑制基序。三、NEDD4L在体内通过促进Ⅰ型干扰素的产生抵御病毒感染我们进一步探讨了NEDD4L在病毒感染性疾病中的作用,我们通过腹腔注射VSV建立VSV感染的动物模型。发现NEDD4Lfl/fl Lyz2cre+小鼠血清中的IFN-β的水平显著低于NEDD4Lfl/fl Lyz2cre-小鼠。然后,我们检测了VSV感染小鼠肝脏、脾脏中VSV的复制水平。数据显示NEDD4Lfl/flLyz2cre+小鼠脾脏和肝脏中VSV RNA扩增水平以及组织研磨液中VSV TCID50显著高于NEDD4Lfl/flLyz2cre-小鼠。提示NEDD4L在体内能够抑制病毒在组织中的复制。结果说明,VSV感染小鼠时,NEDD4L在体内通过促进Ⅰ型干扰素的产生抑制了VSV在组织细胞中的增殖,提高了小鼠的抗病毒能力。综上所述,我们发现在巨噬细胞中,NEDD4L能够促进VSV诱导的Ⅰ型干扰素的产生;明确了NEDD4L依赖其WW结构域直接与TRAF3相互结合,通过其HECT结构域对TRAF3进行K29泛素化修饰,增强了下游信号分子IRF3的活化,促进Ⅰ型干扰素的产生,从而增强小鼠对病毒感染性疾病的防御能力,与此同时,C2结构域在防止过度免疫应答导致的免疫损伤中发挥了作用。本课题揭示了E3泛素连接酶NEDD4L能够调控抗病毒固有免疫应答,丰富了对Ⅰ型干扰素调控的认识,为病毒感染性疾病的免疫治疗以及抗病毒药物的研发提供了新的靶标。
【关键词】：E3泛素连接酶NEDD4L 泛素化 巨噬细胞 VSV Ⅰ型干扰素 固有免疫
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要5-10
• ABSTRACT10-16
• 缩略词表16-18
• 前言18-21
• 第一部分 NEDD4L对VSV诱导Ⅰ型干扰素产生的 选择性促进作用21-36
• 一、材料与方法22-27
• 二、结果27-34
• 三、讨论34-36
• 第二部分 NEDD4L选择性调控Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究36-55
• 一、材料与方法37-40
• 二、结果40-51
• 三、讨论51-55
• 第三部分 NEDD4L在体内通过促进Ⅰ型干扰素的 产生抵御病毒感染55-62
• 一、材料与方法56-58
• 二、结果58-61
• 三、讨论61-62
• 小结62-63
• 参考文献63-68
• 文献综述68-78
• 参考文献73-78
• 在读期间发表论文情况78
• 参加科研工作情况78-79
• 致谢79-80

【参考文献】

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1 Yining He;Zhiwen Xie;Jinglong Dai;Yanjie Cao;Jinlian Hou;Yansheng Zheng;Tianchao Wei;Meilan Mo;Ping Wei;;Responses of the Toll-like receptor and melanoma differentiation-associated protein 5 signaling pathways to avian infectious bronchitis virus infection in chicks[J];Virologica Sinica;2016年01期

2 Germana Grassi;Giorgia Di Caprio;Gian Maria Fimia;Giuseppe Ippolito;Marco Tripodi;Tonino Alonzi;;Hepatitis C virus relies on lipoproteins for its life cycle[J];World Journal of Gastroenterology;2016年06期

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本文编号：603165