单增李斯特菌在群体感应抑制剂作用下的生物学特性研究及其快速检测技术的开发

发布时间：2017-08-04 00:27

  本文关键词：单增李斯特菌在群体感应抑制剂作用下的生物学特性研究及其快速检测技术的开发

  更多相关文章： 单增李斯特菌 群体感应抑制剂 3 4-二溴-2(5H)-呋喃酮 6-氨青霉素烷酸 p60蛋白 免疫磁珠-酶联免疫

【摘要】：单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM),简称单增李斯特菌,是一种常见的食源性致病菌,极易在食品或加工环境中残留,从而引起各种动物源性冷藏食品安全问题。因此,为了有效预防控制LM的感染,提高LM检测效率,本文初步探究了群体感应抑制剂对LM菌落生长、生物膜形成以及LM侵染细胞的影响,并建立一种快速高效检测LM方法。主要实验内容如下:(1)通过测定菌落生长曲线、细菌总蛋白含量、胞外多糖含量变化规律,并通过结晶紫染色法及扫描电镜观察生物膜形态,研究群体感应抑制剂3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮和6-氨青霉素烷酸对LM生物学特性的影响等。结果表明,3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮对LM的最小抑菌浓度(MIC)为25μg/mL,最低致死剂量(MBC)为400μg/mL;6-氨青霉素烷酸对LM的MIC为3.12μg/mL,MBC为100μg/mL。两种群体感应抑制剂在一定的工作浓度下,对LM的菌落的生长及生物膜形成均有着一定的调控作用,且随着抑制剂浓度的增加,调控作用逐渐增强。(2)通过MTT检测、乳酸脱氢酶含量检测、细菌黏附率检测等实验,研究3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮和6-氨青霉素烷酸分别在MIC,5MIC,10MIC浓度下,对LM侵染细胞的影响。当3,4-二溴-2(5H)-呋喃酮浓度分别为MIC,5MIC,10MIC时,其对LM侵染Caco-2细胞产生了一定的影响,黏附率抑制率分别为44.41%,67.68%和85.28;而在6-氨青霉素烷酸作用下,最终的黏附抑制率分别为12.17%,59.60%和76.51%。结果表明:LM与Caco-2细胞共同培养时,两种抑制剂均对LM黏附Caco-2细胞有着明显的抑制作用,且随着抑制剂浓度的增加,抑制作用也逐渐增强。(3)将LM毒力基因iap经过原核克隆与表达,得到的表达产物p60蛋白作为免疫原免疫动物制备多克隆抗体,通过抗体与磁珠的偶联获得抗LM免疫磁珠,建立一种免疫磁珠分离技术结合酶联免疫快速检测LM方法。结果表明:建立的免疫磁珠-酶联免疫法,灵敏性为1.2×10~5 cfu/mL,最低检测限为31cfu/mL,其板内变异系数平均为3.14%,板间变异系数为2.69%,与荧光假单胞菌、大肠杆菌、粪肠球菌交叉反应率均小于0.1%,对样品的平均加标回收率为96.4%。满足LM的检测需要。
【关键词】：单增李斯特菌 群体感应抑制剂 3 4-二溴-2(5H)-呋喃酮 6-氨青霉素烷酸 p60蛋白 免疫磁珠-酶联免疫
【学位授予单位】：中国计量大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378
【目录】：

• 致谢5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 1 绪论15-25
• 1.1 概述15
• 1.2 LM的生物学特性15
• 1.3 LM的危害15-16
• 1.4 LM的致病机理16-20
• 1.4.1 毒力因子16-18
• 1.4.2 生物膜18-19
• 1.4.3 群体感应19-20
• 1.4.4 侵染细胞的能力20
• 1.5 LM的检测技术20-24
• 1.5.1 传统分离检测技术20-21
• 1.5.2 PCR检测技术21-22
• 1.5.3 环介导等温扩增检测技术22
• 1.5.4 胶体金免疫层析检测技术22
• 1.5.5 酶联免疫吸附检测技术22-24
• 1.6 主要研究内容及研究意义24-25
• 2 群体感应抑制剂对单增李斯特菌菌落生长及生物膜形成的影响25-43
• 2.1 实验材料26
• 2.1.1 实验菌株26
• 2.1.2 实验试剂26
• 2.1.3 实验仪器26
• 2.2 实验方法26-30
• 2.2.1 测定QSI最小抑菌浓度及最低致死剂量26-27
• 2.2.2 QSI对LM菌落生长的影响27
• 2.2.3 QSI对LM总蛋白及胞外多糖含量的影响27-28
• 2.2.4 QSI与抗生素抑菌效果的比较28
• 2.2.5 QSI对LM生物膜形成的影响28-30
• 2.3 结果与讨论30-41
• 2.3.1 MIC和MBC的确定30
• 2.3.2 LM生长曲线的测定30-31
• 2.3.3 LM总蛋白及多糖含量变化曲线的测定31-34
• 2.3.4 QSI与抗生素抑菌效果的比较34-36
• 2.3.5 QSI作用下LM生物膜形成的研究36-41
• 2.4 本章小结41-43
• 3 群体感应抑制剂对单增李斯特菌侵染细胞的影响43-50
• 3.1 实验材料43-44
• 3.1.1 实验菌株和细胞43
• 3.1.2 实验试剂及主要耗材43-44
• 3.1.3 实验仪器44
• 3.2 实验方法44-46
• 3.2.1 单增李斯特菌的增菌培养44
• 3.2.2 Caco-2细胞的培养44-45
• 3.2.3 细胞增殖实验45
• 3.2.4 乳酸脱氢酶活性测定45-46
• 3.2.5 细菌黏附性测定46
• 3.3 结果与讨论46-49
• 3.3.1 MTT检测细胞增殖毒性46-47
• 3.3.2 乳酸脱氢酶活性测定47-48
• 3.3.3 QSI作用下LM黏附率的测定48-49
• 3.4 本章小结49-50
• 4 单增李斯特菌多克隆抗体的制备及快速检测方法的建立50-69
• 4.1 实验材料50-51
• 4.1.1 主要菌种和实验动物50
• 4.1.2 主要试剂50-51
• 4.1.3 主要实验仪器51
• 4.2 实验方法51-60
• 4.2.1 主要缓冲液的配制51-54
• 4.2.2 感受态细胞的制备54
• 4.2.3 iap基因的扩增54-55
• 4.2.4 表达载体的构建与鉴定55
• 4.2.5 重组蛋白p60的诱导表达及鉴定55-57
• 4.2.6 多克隆抗体的制备57
• 4.2.7 抗血清效价的测定57-58
• 4.2.8 多克隆抗体的纯化及其与磁珠的偶联58
• 4.2.9 最佳工作浓度的确定58-59
• 4.2.10 标准曲线的建立59
• 4.2.11 ELISA方法的特异性检测59-60
• 4.2.12 ELISA方法的重复性检测60
• 4.2.13 加标回收率的测定60
• 4.3 结果与讨论60-68
• 4.3.1 iap基因的扩增60-62
• 4.3.2 表达载体的构建与鉴定62-63
• 4.3.3 重组蛋白的诱导表达及表达产物的特异性鉴定63-64
• 4.3.4 抗血清效价的测定64
• 4.3.5 最佳工作浓度的确定64-65
• 4.3.6 ELISA标准曲线的建立65-66
• 4.3.7 ELISA方法的特异性检测66
• 4.3.8 ELISA方法的重复性检测66-67
• 4.3.9 加标回收率的测定67-68
• 4.4 本章小结68-69
• 5 结论与展望69-71
• 5.1 主要结论69
• 5.2 展望69-71
• 参考文献71-78
• 作者简历78

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 丁建英;韩剑众;;食品中单增李斯特菌的存在现状及检测方法研究进展[J];食品研究与开发;2008年12期

2 熊国华;于莉;曹际娟;曹远银;王静;;单增李斯特菌免疫胶体金试纸条快速检测[J];中国公共卫生;2008年02期

3 侯敏;翟珏明;廖斌;文静波;;从袋装生鲜食品中检出单增李斯特菌[J];中国卫生检验杂志;2010年01期

4 薛超波;戴意飞;王萍亚;孙瑛;;舟山市6类食品中单增李斯特菌污染情况监测[J];海峡预防医学杂志;2010年03期

5 李秀娟;徐保红;高伟利;李波;宋红梅;张仁伟;;单增李斯特菌鉴定方法比较研究[J];现代预防医学;2011年01期

6 冯晓慧;王庆国;王仁欢;陈庆敏;苏亚东;朱瑞良;朱立贤;罗欣;;牛肉中单增李斯特菌的热失活模型[J];微生物学报;2011年05期

7 ;4b型单增李斯特菌更易引发疾病[J];中国乳业;2011年04期

8 张春琳;张家国;;单增李斯特菌增殖的影响因素研究[J];食品研究与开发;2011年07期

9 张加林;杨林娴;;单增李斯特菌的食源性污染状况及检测方法[J];医学理论与实践;2012年08期

10 付瑞燕;周阳;祝长青;;食品中单增李斯特菌检测技术研究进展[J];安徽农业大学学报;2012年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 龙轶;周小明;邢达;;基于磁珠分离和超分支滚环扩增的单增李斯特菌电化学发光检测[A];第七届全国光生物学学术会议论文摘要集[C];2010年

2 丁建英;韩剑众;;食品中单增李斯特菌的存在现状及检测方法研究进展[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年

3 张耀祺;石磊;;分离自生肉的单增李斯特菌的血清型及脉冲场凝胶电泳分型研究[A];“亚运食品安全与广东食品产业创新发展”学术研讨会暨2009年广东省食品学会年会论文集[C];2009年

4 陈慧燕;;单增李斯特菌室间比对活动实验室结果评价[A];2009年卫生检验新技术学术研讨会会刊[C];2009年

5 陈健舜;方维焕;;食品中单增李斯特菌的分子流行病学特征与致病力研究[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集（下册）[C];2009年

6 郑华英;江元山;吕均;熊燕;龙一兵;曾莹春;;单增李斯特菌食品分离株多重PCR鉴定分型[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年

7 何冬梅;王洪敏;柯昌文;邓小玲;杨杏芬;赖蔚傮;柯碧霞;李柏生;谭海玲;;单增李斯特菌检测基因芯片的研制与评价[A];2011广东省预防医学会学术年会资料汇编[C];2011年

8 斯国静;俞骅;刘涛;胡俊;;单核细胞增生李斯特菌在市售食品中污染现状分析[A];2011年浙江省医学会医学病毒学分会、医学微生物与免疫学分会学术年会论文汇编[C];2011年

9 郭明星;朱堂明;陈晨;赵晖;王振华;陈建军;徐新生;;湖北省水产品中单增李斯特菌基因分型研究[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年

10 程超男;张笑言;彭媛;白家磊;刘原媛;宁保安;高志贤;;基于3-巯基丙酸修饰金电极构建电化学免疫传感器检测牛奶中的单增李斯特菌[A];天津市生物医学工程学会第三十三届学术年会论文集[C];2013年

中国重要报纸全文数据库 前8条

1 ;重视单增李斯特菌风险防范[N];中国医药报;2014年

2 张启华邋姜文辉;烟台首次从进口水产品中检出单增李斯特菌[N];中国国门时报;2007年

3 记者　 胡其峰;进口日本食品连续出现质量问题[N];光明日报;2006年

4 黄全权;进口日本食品连出问题,质检交涉[N];新华每日电讯;2006年

5 夏文俊;进口日本食品连续出现质量问题[N];中国质量报;2006年

6 吕壮;日本输华食品频现安全问题[N];中华工商时报;2006年

7 高亚兰;小心：进口日本食品频现质量问题[N];国际商报;2006年

8 记者　黄全权;进口日本食品连续出现问题[N];人民日报;2006年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 方春;单核细胞增生李斯特菌谱系Ⅲ强毒株与弱毒菌株比较基因组及致病力差异机制[D];浙江大学;2015年

2 亢春雨;食源性单核增生性李斯特氏菌的分布、遗传多态性及其毒理机制研究[D];河北农业大学;2015年

3 张一敏;三种有机酸对单增李斯特菌诱导性耐酸响应研究[D];山东农业大学;2014年

4 李长城;三文鱼鱼籽中单增李斯特菌预测模型建立及控制研究[D];福建农林大学;2015年

5 夏叶;单核细胞增生李斯特菌：应激转录组学与RsbX对SigB表达和细菌存活的调控[D];浙江大学;2015年

6 郗远;植物提取物对单增李斯特菌的抑制作用及乳化香肠的品质影响[D];南京农业大学;2011年

7 王建锋;抗单核细胞增多性李斯特菌溶血素化合物的发现及作用机制研究[D];吉林大学;2015年

8 隋建新;单增李斯特菌鸡卵黄抗体的抑菌性能及其机理研究[D];中国海洋大学;2010年

9 田静;熟肉制品中单增李斯特菌的风险评估及风险管理措施的研究[D];中国疾病预防控制中心;2010年

10 张辉;单增李斯特菌ActA的表达、免疫原性及胶体金试纸研制[D];吉林大学;2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 冯晓慧;单增李斯特菌在肉牛屠宰过程中的流行特点及其热失活模型的建立[D];山东农业大学;2011年

2 于旖斯;食品中单增李斯特菌的分离、鉴定及抑制研究[D];大连工业大学;2010年

3 王昊宇;食品中单增李斯特菌的分离鉴定及PCR快速检测方法的研究[D];大连工业大学;2013年

4 周旋;姜黄素抑制单增李斯特菌溶血素活性的分子机制研究[D];吉林大学;2016年

5 张星星;漆黄素对单增李斯特菌感染妊娠小鼠流产的保护作用[D];吉林大学;2016年

6 解新方;单增李斯特菌表面增强拉曼光谱检测技术研究[D];天津科技大学;2015年

7 李云霞;纳米磁珠对单增李斯特菌低场磁共振检测的影响研究[D];上海师范大学;2016年

8 欧娅;单增李斯特菌双组分系统应答调节蛋白基因RS11565的功能研究[D];华中农业大学;2016年

9 付娇娇;环境胁迫应答因子SigB影响单增李斯特菌生物被膜形成的初步机制研究[D];上海海洋大学;2016年

10 宣晓婷;弱酸性电位水对单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的杀菌及亚致死研究[D];浙江大学;2016年

，

本文编号：617014