鹦鹉热衣原体持续性感染经Bcl-2家族蛋白和ERK抑制HeLa细胞凋亡

发布时间：2017-08-04 07:26

  本文关键词：鹦鹉热衣原体持续性感染经Bcl-2家族蛋白和ERK抑制HeLa细胞凋亡

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【摘要】：背景与目的:细胞凋亡是机体清除病原微生物感染的重要防御机制。本课题组的前期研究表明鹦鹉热衣原体(Cps)感染HeLa细胞后,可通过抑制其凋亡而发挥持续性感染,但其机制尚不明确,本研究旨在观察人重组干扰素-γ(rh IFN-γ)诱导Cps 6BC持续感染条件下,观察其对HeLa细胞凋亡相关蛋白表达的影响,从而初步阐明Cps持续性感染对凋亡的调节机制。方法:体外培养HeLa细胞,加入MOI为2的Cps 6BC菌株和35ng/m L rh IFN-γ诱导持续性感染,分别于感染后0、4、8、12、24h收集细胞进行Hochest33258和TUNEL荧光染色观察HeLa细胞凋亡情况;采用间接免疫荧光染色实验(IFA)检测核形态以及细胞色素c(Cyt.C)和线粒体膜电位(MMP)的变化,同时采用Western blot检测Cps持续性感染对HeLa细胞中Fas、Fas-L、Caspase 8、Caspase 3、Cyt.C、t Bid、Bad、Bim、Mcl-1表达水平及ERK磷酸化的影响。结果:(1)Cps 6BC持续性感染HeLa细胞0、4、8、12、24h,Hochest33258和TUNEL染色结果显示其凋亡率明显降低,但感染24h后凋亡率有所增高但仍低于对照水平;(2)而Cps持续性感染20h后能显著抑制STS对HeLa凋亡的诱导效应,形态学上Cps持续感染的细胞核与正常HeLa细胞核大小、形态无明显差异;(3)Cps持续感染4h后Caspase 3表达逐渐增加,而其活性形式(Cleaved Caspase3)随着时间的延长而逐渐降低;(4)未感染细胞Mcl-1和Bad表达较低。Cps持续性感染4h后,Mcl-1逐渐增加,并持续至24h。而Cps持续性感染4h后,胞内Bad表达明显增高,但在4~24h内呈恒定表达;(5)Cps持续感染4h后,可显著抑制CCCP诱导HeLa释放Cyt.C,并持续至24h;此外,Cps持续性感染后也能一定程度削弱CCCP对MMP的影响;(6)随着Cps持续性感染时间的延长,HeLa细胞Bim EL水平随之降低,Bims表达增高。同时细胞内t Bid、Cyt.C的表达水平也随着感染时间的延长而逐渐减少;(7)随持续性感染时间的延长,HeLa细胞内Fas及其配体Fas-L的表达水平逐渐减少。细胞内Caspase 8,其活性形式Cleaved Caspase 8含量也随持续性感染时间延长而降低;(8)Cps持续性感染4~24h,磷酸化ERK水平随着感染时间的增加而增高,并能增强STS处理后ERK的磷酸化水平结论:Cps 6BC持续性感染通过影响Bcl-2家族蛋白Mcl-1、t Bid和Bim表达以及ERK磷酸化,最终调控Cyt.C释放和细胞MMP而抑制HeLa细胞凋亡。
【关键词】：鹦鹉热衣原体 持续性感染 抑制细胞凋亡 人重组干扰素-γ
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R374.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-9
• 主要缩略中英文缩写索引9-13
• 第一章 前言13-17
• 第二章 实验材料17-21
• 1 主要实验器材17-18
• 2 鹦鹉热衣原体Cps 6BC标准株18
• 3 细胞株18
• 4 主要试剂18-19
• 5 主要抗体19
• 6 溶液配制19-20
• 7 其他20-21
• 第三章 实验方法21-31
• 1 细胞的复苏、培养、传代及冻存21
• 2 Cps的培养和包涵体形成单位计数21-23
• 3 诱导细胞凋亡及Cps持续性感染23
• 4 Hochest 33258 及TUNEL染色23-24
• 5 间接免疫荧光法检测Cyt.C24-25
• 6 间接免疫荧光法检测线粒体膜电位25
• 7 Western Blot检测Mcl-1、Bad、t Bid、Bim、Cyt.C、ERK蛋白表达25-29
• 8 统计学分析29-31
• 第四章 实验结果31-43
• 1 Cps持续性感染抑制HeLa细胞凋亡31-32
• 2 Cps持续性感染抑制凋亡诱导剂的促凋亡效应32-33
• 3 Cps持续性感染通过抑制Caspase 3 表达抑制细胞细胞凋亡33-34
• 4 Cps持续性感染上调Mcl-1 和Bad表达34-35
• 5 Cps持续性感染经线粒体途径抑制HeLa细胞凋亡35-38
• 6 Cps持续性感染下调HeLa细胞内t Bid和Bim和线粒体Cyt.C表达38-39
• 7 Cps持续性感染下调Fas和Caspase 8 表达39
• 8 Cps持续性感染通过调控ERK抑制宿主细胞凋亡作用39-43
• 第五章 讨论43-47
• 第六章 结论47-49
• 参考文献49-57
• 综述 衣原体抗宿主细胞凋亡调控机制研究进展57-65
• 参考文献62-65
• 攻读硕士学位期间主要研究成果65-67
• 资助本论文试验的课题项目和平台67-69
• 致谢69

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本文编号：618319