人源抗TLR4抗体IgG的制备及其中和作用机制

发布时间：2017-08-10 03:22

  本文关键词：人源抗TLR4抗体IgG的制备及其中和作用机制

  更多相关文章： Toll样受体4 全人源抗体 中和抗体 炎症

【摘要】：TLR4(Toll-like receptor 4,TLR4)是Toll样受体家族的成员之一,是脂多糖(lipopolysacc-haride,LPS)的模式识别受体。脂多糖是细菌内毒素(endotoxin)的主要成分,是革兰氏阴性细菌胞壁的成分[1,2]。内毒素有多种生物活性,进入人体血液可造成内毒素血症(endotoxemia,ETM),可引起多种病理生理过程变化如发热、休克、弥漫性血管内凝血和粒细胞减少等,甚至造成严重后果如呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome,ARDS),急性肾衰竭(acute renal failure,ARF),甚至多器官功能衰竭等多种疾病,最终可因内毒素休克死亡[3,4]。TLR4广泛表达在免疫细胞表面,其中既包括非特异免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞,又包括介导特异免疫反应的T淋巴细胞和B淋巴细胞[5]。LPS在细胞外被识别后导致TLR4受体寡聚化激活,将LPS刺激信号向细胞内转导,通过MyD88依赖和非MyD88依赖的两条途径触发一系列的信号激联反应,诱导NF-κB、AP-1和IRF-3等转录因子磷酸化和核转位[6],上调TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IFN-γ等细胞因子的表达,最后启动炎症反应[7,8]。TLR4在内毒素的信号转导通路中起极其重要的作用,是内毒素发挥生物学效应的关键点和内毒素瀑布效应的限速步骤,是整个内毒素信号转导通路的枢纽。阻断TLR4对内毒素信号的转导,是控制内毒素生物学效应最为有效的手段。在先期实验中,本课题组已从库容为5.76×109的全人源Fab抗体库中筛选出多株高结合活力抗TLR4 Fab,其中克隆株TLR4L4表现出较高的中和活性。本研究通过基因工程技术和抗体工程技术,制备和表达具有中和活性的全分子人源抗TLR4 IgG,并对表达纯化获得的抗体进行功能鉴定,初步探究其作用机制,为进一步探讨其在炎症治疗中的作用奠定基础。方法:1.重组抗tlr4抗体真核表达载体的构建将抗tlr4lfab可变区序列与人类抗体基因组序列数据库(http://www.imgt.org/)进行比对,根据同源性,修复该抗体核酸序列fr1起始处及fr4结尾处的基因突变。根据infusionpcr原理设计抗tlr4抗体的重、轻链pcr扩增引物,分别使用限制性内切酶切消化抗体真核表达载体pfuse-chig-hg1、pfuse-clig-hl。该两种质粒分别包含igg1型人源重链和轻链(lambda)恒定区基因序列。以tlr4lfab为模板,使用设计合成的if引物扩增抗体重链和轻链可变区序列,将抗体可变区基因pcr产物克隆到抗体真核表达质粒中。转化大肠杆菌dh5α后,筛选阳性克隆并酶切鉴定,对酶切鉴定正确的克隆测序以确认序列连接正确。2.抗tlr4全分子igg的表达和纯化将测序正确的pfuse-chig-hg1-tlr4l4h和250μlpfuse-clig-hl-tlr4l4k重组质粒转染到293freestyle(293f)细胞中,将细胞放在co2摇床培养箱中培养,120小时后收集细胞培养上清。过滤后使用蛋白纯化系统和hitrapproteina预装柱,按标准操作步骤纯化。纯化后使用30kd超滤离心管置换抗体缓冲液并浓缩,使用0.22μm滤膜过滤分装保存。3.抗tlr4igg免疫学特性分析分别使用酶联免疫吸附实验、免疫共沉淀、质谱检测、亲和力检测等对抗tlr4igg的结合性,亲和力进行特性检测分析。4.抗tlr4igg中和作用及机制初步分析建立pma-lps-thp-1炎症细胞模型,检测抗体对thp-1细胞tnf-α蛋白表达水平变化。通过免疫荧光、westernblot等实验检测抗tlr4igg作用前后,thp-1细胞表面md-2和cd14的表达水平变化。结果:1.抗tlr4抗体igg真核重组表达载体的构建及鉴定采用pcr分别扩增出长度389bp的vh基因和325bp的vl基因,通过序列比对、设计引物及酶切载体,经infusionpcr获得pfuse-chig-hg1-tlr4l4h和250μlpfuse-clig-hl-tlr4l4k质粒,转化大肠杆菌dh5α后测序正确。2.抗TLR4抗体IgG表达、纯化使用293 Free style Expression System真核表达抗TLR4 IgG,经检测,该系统表达全分子抗体,得率高,约6mg/100ml,纯度较好。SDS-PAGE结果显示,纯化后的抗体在55kD和25kD左右分别有一条带,分别为抗TLR4 IgG的重链和轻链。3.抗TLR4 IgG特性分析ELISA显示抗TLR4 IgG与重组TLR4蛋白可特异性结合,并具有较好的量效关系。免疫沉淀实验证实抗TLR4 IgG能特异性结合TLR4蛋白,将SDS-PAGE检测的75kDa处的蛋白条带送质谱检测分析,结果显示该抗体结合的蛋白为TLR4。亲和力检测,抗TLR4 IgG的亲和力KD为7.380×10-10。4.抗TLR4 IgG中和作用及机制分析细胞学实验表明随着抗TLR4抗体浓度的增加,抗体对THP-1细胞TNF-α蛋白的表达具有明显抑制作用。Western Blot和免疫荧光显示抗TLR4 IgG作用于THP-1细胞之后,可明显抑制MD-2表达,而CD14的表达没有明显变化,表明抗TLR4 IgG抑制TLR4信号通路的转导的机制可能与MD-2相关,与CD14无明显关联。结论:1.成功构建了全人源抗TLR4抗体的真核表达载体,表达并纯化后的全分子抗TLR4 IgG具有较好的生物学活性。2.初步证明本研究制备的抗TLR4 IgG具有一定的中和作用,其作用机制与抑制MD-2的表达相关,与CD14无明显相关性,对TLR4相关炎症性疾病治疗具有潜在的应用价值。
【关键词】：Toll样受体4 全人源抗体 中和抗体 炎症
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392.11
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-16
• 第一部分 全人源抗TLR4全分子IgG的表达与纯化16-29
• 摘要16
• 1 材料与方法16-25
• 2 结果25-27
• 3 讨论27-29
• 第二部分 全人源抗TLR4 IgG特性鉴定及作用机制29-43
• 摘要29
• 1 材料与方法29-36
• 2 结果36-41
• 3.讨论41-43
• 小结43-44
• 参考文献44-47
• 综述47-59
• 参考文献55-59
• 附录59-60
• 致谢60

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本文编号：648620