沙门菌质粒毒力基因spvB方抗体的制备及其对NF-κB通路的影响

发布时间：2017-08-12 22:31

  本文关键词：沙门菌质粒毒力基因spvB方抗体的制备及其对NF-κB通路的影响

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【摘要】：目的:沙门菌质粒毒力基因spv B编码产物具有ADP核糖基转移酶作用,与细菌毒力关系密切,目前该基因的功能还有很多未知。本研究第一部分通过对沙门菌质粒毒力基因spv B进行生物信息学分析、克隆表达并制备相应抗体,为后续深入研究该基因的功能提供工具和手段。第二部分通过建立沙门菌感染的巨噬细胞模型,研究spv B对NF-κB信号通路相关蛋白IκBα和p65等表达的影响;利用与真核表达载体连接的重组质粒p EGFP-N1-Spv B瞬时转染He La细胞,进一步分析spv B对NF-κB通路的影响,探讨该基因对宿主菌毒力影响的分子机制。方法:一.沙门菌质粒毒力基因spv B的原核表达及其抗体的制备1.通过生物信息学软件分析spv B基因及其编码的蛋白,选取抗原性较高、易表达的氨基酸序列作为克隆序列。2.根据spv B基因序列设计引物,以携带spv B基因的野生型鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium,S.typhimurium,STM)为模板,PCR扩增获得目的片段后与原核表达载体p ET-28a连接,将质粒p ET28a-Spv B转化至大肠埃希菌BL21(DE3)后,IPTG诱导表达并纯化。用Spv B蛋白免疫健康小鼠,制备抗Spv B多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性。二.沙门菌质粒毒力基因spv B对NF-κB信号通路的影响1.以携带spv B基因的鼠伤寒沙门菌野生株STM-WT、消除spv B基因的突变株STM-Δspv B及回补株STM-c-Δspv B分别与小鼠腹腔巨噬细胞J774A.1共培养,建立细胞感染模型。Western blot检测NF-κB通路相关蛋白IκBα和p65等的表达;荧光显微镜下观察p65的核转运;Western blot检测Caspase-3的活化;比色法测定Caspase-3的活性;免疫共沉淀法检测IκBα的泛素化水平。2.利用p RL-TK(内参质粒)、p NFκB-luc(报告基因质粒)、p EGFP-N1及p EGFP-N1-Spv B瞬时转染He La细胞,加入TNF-α刺激后,通过双荧光素酶报告基因检测系统检测spv B对NF-κB通路的影响;利用p EGFP-Spv B真核表达载体瞬时转染He La细胞,TNF-α刺激后,Western blot检测spv B基因对IκBα、p65等蛋白表达的影响。结果:一.沙门菌质粒毒力基因spv B抗体的制备1.成功构建p ET28a-Spv B原核表达重组质粒,经IPTG诱导结果显示,重组蛋白表达且主要存在于包涵体中。2.将纯化的Spv B蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,经Western blot验证该抗体能特异结合Spv B蛋白。二.沙门菌质粒毒力基因spv B对NF-κB通路的影响1.Western blot检测NF-κB通路相关蛋白IκBα和p65的表达,结果显示细菌与细胞共培养30 min后,STM-Δspv B感染组细胞IκBα的表达量显著低于STM-WT感染组(P0.01),与STM-c-Δspv B感染组相比两组间无显著性差异(P0.05);感染4 h后,STM-Δspv B感染组IκBα的表达量显著低于STM-WT和STM-c-Δspv B感染组(P0.01);感染4 h和8 h后,STM-Δspv B感染组Phospho-p65的表达水平高于STM-WT和STM-c-Δspv B感染组(P0.05)。2.荧光显微镜下观察p65的核转运,结果显示感染8 h后,STM-Δspv B感染组细胞核中p65的表达显著高于STM-WT和STM-c-Δspv B感染组。3.Western blot检测Caspase-3的激活,结果显示感染4 h和8 h后,STM-WT和STM-c-Δspv B感染组细胞Caspase-3出现明显的活化;比色法测定Caspase-3的活性,结果显示感染4 h和8 h后,STM-WT和STM-c-Δspv B感染组细胞Caspase-3活性高于STM-Δspv B感染组(p0.01)。4.免疫共沉淀检测IκBα的泛素化水平,结果显示用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞24 h,细菌与细胞共培养4 h后,STM-Δspv B感染组IκBα的泛素化水平高于STM-WT和STM-c-Δspv B感染组,而未经MG132处理各组间IκBα的泛素化差异不明显。5.双荧光素酶报告基因检测系统检测spv B对NF-κB通路的影响,结果显示p EGFP-N1或p EGFP-N1-Spv B瞬时转染He La细胞24 h,TNF-α处理后,p EGFP-N1-Spv B转染组NF-κB的激活程度显著低于p EGFP-N1转染组(P0.01);p RL-TK、p NFκB-luc转染He La细胞24 h,三株受试菌感染细胞20 h后,STM-Δspv B感染组NF-κB的激活程度显著高于STM-WT和STM-c-Δspv B感染组(P0.01)。6.Western blot检测spv B基因对IκBα和p65等蛋白表达的影响,结果显示利用p EGFP-N1-Spv B真核表达载体瞬时转染He La细胞,TNF-α处理后,p EGFP-N1-Spv B质粒转染组Phospho-p65的表达显著低于p EGFP-N1转染组(P0.01)而IκBα的表达显著高于p EGFP-N1转染组(P0.01)。结论:1.成功构建Spv B原核表达载体,获得具有抗原性的Spv B蛋白及其多克隆抗体,为后续深入研究该基因的功能奠定了基础。2.利用沙门菌感染巨噬细胞和真核表达载体p EGFP-N1-Spv B转染的He La细胞模型,证实spv B抑制NF-κB通路的激活,为进一步探索spv B基因影响细菌毒力的分子机制提供理论和实验依据。
【关键词】：鼠伤寒沙门菌 毒力基因spvB 抗体 NF-κB
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-16
• 第一部分 沙门菌质粒毒力基因spvB的原核表达及其抗体的制备16-31
• 1. 材料与方法16-25
• 1.1 材料16-20
• 1.2 方法20-25
• 2. 结果25-29
• 2.1 spvB的一般生物信息学特征25-26
• 2.2 spvB基因的PCR扩增及原核表达载体的构建26-27
• 2.3 SpvB蛋白的诱导表达27-28
• 2.4 SpvB蛋白的纯化及鉴定28-29
• 2.5 SpvB多克隆抗体的鉴定29
• 3. 讨论29-31
• 第二部分 沙门菌质粒毒力基因spvB对NF-κB信号通路的影响31-50
• 1. 材料与方法33-40
• 1.1 材料33-34
• 1.2 方法34-40
• 2. 结果40-47
• 2.1 平板菌落计数法计数胞内活菌数40
• 2.2 Western blot检测IκBα、p65、Phospho-p65 蛋白的表达40-41
• 2.3 荧光显微镜下观察p65 在细胞中的定位41-42
• 2.4 免疫共沉淀检测IκBα的泛素化水平42-43
• 2.5 Western blot和比色法检测Caspase-3 的活性43-44
• 2.6 真核表达载体pEGFP-N1-SpvB的构建及鉴定44
• 2.7 双荧光素酶报告基因检测系统检测spvB对NF-κB通路的影响44-46
• 2.8 Western blot检测spvB对NF-κB通路的影响46-47
• 3. 讨论47-50
• 小结50-51
• 参考文献51-55
• 综述 模式生物酵母在自噬研究中的应用55-65
• 参考文献61-65
• 攻读学位期间公开发表论文65-66
• 本课题所获的基金资助66-67
• 英文缩略词表67-68
• 致谢68-70

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本文编号：664003