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靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白shRNA慢病毒干扰质粒的构建及鉴定

发布时间:2017-08-13 00:20

  本文关键词:靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白shRNA慢病毒干扰质粒的构建及鉴定


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【摘要】:目的构建靶向MA104细胞多聚嘧啶序列结合蛋白(polypyrimidine tract-binding protein,PTB)的shRNA慢病毒干扰质粒,并对其进行鉴定。方法根据Gen Bank中登录的PTB的基因序列设计并合成2条靶向MA104细胞PTB基因的shRNA干扰序列(shPTB1、shPTB2)和1条阴性对照序列(shControl),分别插入载体p LVshRNA-EGFP(2A)Puro后,构建慢病毒重组质粒;利用HEK293Ta细胞包装针对PTB基因的shRNA的重组慢病毒颗粒;感染MA104细胞后,经Resl-time PCR、免疫荧光和Western blot法分别检测MA104细胞中PTB基因的转录和蛋白表达水平。结果 PCR及测序鉴定证明3种重组慢病毒质粒构建正确。3种重组慢病毒质粒转染HEK293Ta细胞48 h后,均可见绿色荧光表达,3组细胞的病毒滴度均为2×106 TU/ml。3种重组慢病毒感染MA104细胞48 h后均可见绿色荧光表达。经嘌呤霉素加压筛选后,p LVshPTB1-EGFP-2A和p LVshPTB2-EGFP-2A组MA104细胞仅有少量细胞于细胞核中表达,p LVshPTB1-EGFP-2A组MA104细胞中PTB基因转录及蛋白表达的水平均低于p LVshPTB2-EGFP-2A组。结论成功构建了靶向MA104细胞PTB蛋白的shRNA重组慢病毒,shRNA序列可成功下调PTB在MA104细胞中的表达,为PTB在RV增殖过程中调控作用的研究奠定了基础。
【作者单位】: 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室;
【关键词】MA细胞 多聚嘧啶序列结合蛋白 慢病毒质粒 RNA干扰
【基金】:云南省科技计划项目(2014BC008) “协和青年基金资助” “中央高校基本科研业务费专项资金资助”(33320140082)
【分类号】:R373
【正文快照】: 轮状病毒(rotavirus,RV)是引起婴幼儿严重腹泻的主要病原体之一。RV具有季节流行性和婴幼儿易感性等特点,虽然已有相应的疫苗可预防和控制RV感染,但每年全球由于RV感染引起的儿童肠胃炎病例数仍达约1.25亿,导致约40万例5岁以下儿童死亡[1]。目前,RV的感染敏感性机制尚不明确,

本文编号:664426

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