铁蛋白基因在骨髓间充质干细胞成神经分化中的可诱导表达及MR成像

发布时间：2017-08-24 04:12

  本文关键词：铁蛋白基因在骨髓间充质干细胞成神经分化中的可诱导表达及MR成像

  更多相关文章： 间充质干细胞 神经诱导分化 报告基因FTH1 磁共振成像

【摘要】：背景与目的细胞活体示踪是分子影像学领域的重要内容之一,用于示踪移植细胞的方法主要有磁标记和报告基因成像两种,其中以后者更具优势。铁蛋白基因(FTH1)作为一种较为成熟的MRI报告基因已成功用于多种类型细胞的示踪研究。目前多数研究结果显示,由于FTH1基因整合到细胞的基因组,其表达不受细胞分裂增殖的影响,但是否受干细胞诱导分化的影响目前尚不明确。本研究通过构建携带FTH1基因的慢病毒载体,感染骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),将MSCs向神经元样细胞诱导分化,并检测MSCs成神经分化前后的FTH1表达情况,探讨FTH1基因表达对干细胞成神经分化的影响,以及成神经分化对FTH1基因表达的影响,明确FTH1在神经元样细胞内的聚铁能力是否能够引起足够的MRI信号改变,为进一步实现体内干细胞神经分化的MRI活体示踪奠定基础。方法1携载Tet-on可调控FTH1基因的慢病毒载体构建及病毒包装合成FTH1基因并插入到Tet-on可诱导表达慢病毒载体上,重组携载可调控FTH1基因慢病毒质粒(p LV-Tet-FTH1),PCR及DNA测序鉴定。再将p LV-Tet-FTH1载体质粒和包装质粒共转染293 T细胞,生产慢病毒(LV-Tet-FTH1)并测定滴度。2携载Tet-on可调控FTH1基因的MSCs(MSCs-Tet-FTH1)建立以LV-Tet-FTH1转染MSCs,构建含有可调控FTH1报告基因的MSCs(MSCs-Tet-FTH1),嘌呤霉素筛选。3 FTH1在MSCs-Tet-FTH1细胞的可诱导表达及聚铁效应在MSCs-Tet-FTH1的完全培养基内加入梯度浓度的诱导剂(DOX)进行诱导表达,经过一定时间后采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测FTH1基因表达产物铁蛋白,确定DOX最佳浓度和最佳时间。CCK-8试剂检测病毒转染和枸橼酸铁铵(FAC)对细胞增殖活性的影响,普鲁士蓝染色和电镜观察MSCs-Tet-FTH1细胞的转铁效应,磁共振观察细胞内FTH1基因表达是否引起T2WI信号变化。4 MSCs成神经诱导分化和鉴定采用全反式维甲酸和MNM神经诱导液诱导细胞成神经分化,观察细胞形态学变化,同时检测神经元特异性表面标志物神经元特异性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)和微管蛋白-2(MAP-2)。5诱导分化后FTH1基因表达及聚铁能力的检测MSCs成神经诱导分化后,Western Blot检测基因表达产物铁蛋白,普鲁士蓝色和透射电镜检测基因表达产物的聚铁能力,磁共振检测T2WI信号变化。结果1携载FTH1基因的可调控Tet-on慢病毒载体重组、病毒包装和滴度测定利用DNA测序、基因重组等技术证实已成功构建Tet-on可调控FTH1基因表达的慢病毒载体系统,再进行慢病毒包装,得到病毒,检测其滴度为1×109Tf U/ml。2携载Tet-on可调控FTH1基因的慢病毒对MSCs的转染及筛选成功建立并筛选出转染FTH1基因的MSCs(MSCs-Tet-FTH1),Western Blot检测到FTH1基因表达产物的表达。3 MSCs-Tet-FTH1细胞内FTH1基因的可诱导表达及其聚铁效应Western Blot结果显示,FTH1基因表达产物与诱导剂DOX存在量-浓度和量-时间依赖关系。1μg/ml的DOX诱导3 d后,FTH1基因的表达产物量达到峰值。在完全培养基内添加一定浓度DOX和枸橼酸铁铵时,细胞可从周围摄取铁。3.0 T磁共振扫描显示:MSCs-Tet-FTH1细胞在T2WI信号明显降低,对照组MSCs信号未见降低。普鲁士蓝染色和电镜显示:添加1μg/ml DOX和500μM FAC后,MSCs-Tet-FTH1细胞内见大量铁颗粒,而对照组仅见部分细胞内有少许铁颗粒。4 MSCs-Tet-FTH1成神经诱导分化及鉴定MSCs在全反式维甲酸(ATRA)预诱导24 h,再用MNM成神经诱导液诱导分化24 h后,细胞形态发生明显变化,呈典型神经元形态,特异标志物NSE、Nestin、MAP-2均呈强阳性表达,实验组细胞MSCs-Tet-FTH1经相同方法诱导分化后亦检测到上述变化。说明转染病毒对MSCs的诱导分化能力没有明显影响。5 MSCs-Tet-FTH1诱导分化后的FTH1基因表达及聚铁能力MSCs-Tet-FTH1成神经诱导分化后,Western Blot检测:Neurons-Tet-FTH1内铁蛋白仍有大量表达,普鲁士蓝染色观察到细胞内有大量蓝色铁染颗粒,透射电镜亦检测到有大量黑色致密颗粒。MRI显示诱导分化后细胞仍能引起T2WI信号显著降低。结论成功将含有FTH1基因的MSCs(MSCs-Tet-FTH1)诱导分化为神经元样细胞Neurons-Tet-FTH1,明确了成神经诱导分化不影响MSCs细胞内FTH1基因的表达,基于FTH1的MRI报告基因成像可用于MSCs神经分化后的检测,这将为干细胞治疗提供一种可调控的、安全的、长期的示踪方法。
【关键词】：间充质干细胞 神经诱导分化 报告基因FTH1 磁共振成像
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-15
• 前言15-17
• 1 材料和方法17-26
• 2 结果26-33
• 3 讨论33-35
• 全文总结35-36
• 参考文献36-39
• 文献综述39-50
• 参考文献44-50
• 致谢50-51
• 攻读硕士期间发表论文51

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本文编号：729115