结核分枝杆菌干扰巨噬细胞自噬的初步研究

发布时间：2017-09-09 16:27

  本文关键词：结核分枝杆菌干扰巨噬细胞自噬的初步研究

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【摘要】：由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)引起的结核病是世界上最严重的细菌性疾病之一。尽管宿主细胞存在着多种清除结核分枝杆菌的策略,但结核分枝杆菌也进化出了对抗宿主细胞杀伤作用的生存机制。研究表明,细胞自噬与结核分枝杆菌的相互斗争,是影响该菌能否在宿主细胞中生存的重要因素。然而,参与这一过程的细菌和宿主相关基因仍未得到详细的阐释。本研究以结核分枝杆菌作为研究对象,通过构建青色或蓝色荧光表达菌株和双荧光指示自噬的巨噬细胞系以及一套能够抑制和激活真核基因表达的CRISPRi/CRISPRa系统作为研究工具,以此来揭示调控结核分枝杆菌在宿主细胞中存活的相关基因。主要研究内容如下:1.青色/蓝色荧光结核分枝杆菌H37Ra的构建。为了方便利用荧光显微镜对结核分枝杆菌的直接观察,我们将能够表达青色或者蓝色荧光蛋白的pMV261-CFP/BFP质粒导入到结核分枝杆菌H37Ra中。通过筛选,得到了能够稳定表达青色或蓝色荧光的结核分枝杆菌。2.双荧光指示自噬的巨噬细胞系的构建。首先,我们将EGFP基因突变为GFPph使其对pH环境更加敏感,并与mCherry和LC3基因进行串联表达。之后,利用CRISPR/Cas基因编辑技术,将GFPph-mCherry-LC3融合基因插入到Raw264.7细胞基因组中。通过多轮的挑斑筛选以及流式技术的纯化,我们获得了高阳性率的GphML-Raw264.7细胞。通过对基因组的测序以及Western Blot技术验证相关蛋白的表达,确认细胞系的构建成功。最后,利用自噬诱导剂进行验证,确认该细胞系可以有效地指示自噬的发生。3.结核分枝杆菌蛋白对自噬干扰的分析。为了探究哪些细菌蛋白通过干预自噬而参与调控结核分枝杆菌长期潜伏于巨噬细胞,我们将经过密码子优化的33个结核相关蛋白与GphML-Raw264.7细胞进行共孵育,通过雷帕霉素诱导自噬发生,在特定时间点利用激光共聚焦显微镜分析自噬的发生状况。结果发现Rv0847处理细胞中绿色荧光点与红色荧光点可以共定位,说明Rv0847可以干扰自噬体与溶酶体的融合。以上结果说明Rv0847可能干扰自噬溶酶体的融合,从而参与结核分枝杆菌在细胞内的存活。4.宿主自噬基因gRNA文库的构建。利用CRISPRi/CRISPRa技术,我们可以在真核细胞基因组上抑制或者激活基因的表达。我们将该系统及相关质粒转染293T细胞,结果显示其可有效地激活或者抑制相关基因的表达。之后,我们筛选了所有参与到自噬过程中的相关基因,并通过NCBI获取基因附近的所有序列信息。通过在线分析软件获取最佳gRNA序列。将得到的gRNA序列分别插入到CRISPRi和CRISPRa质粒中,得到关于宿主自噬基因gRNA的文库。进而为下一步探究结核分枝杆菌胞内存活的相关宿主自噬基因奠定基础。
【关键词】：结核分枝杆菌 CRISPR 基因编辑 自噬 巨噬细胞 细胞内生存
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 缩略词表10-12
• 第一章 文献综述12-22
• 引言12
• 1.1 结核分枝杆菌与巨噬细胞的相互作用12-16
• 1.1.1 细胞免疫与结核分枝杆菌13
• 1.1.2 自噬与结核分枝杆菌13-14
• 1.1.3 活性氧成分与结核分枝杆菌14-15
• 1.1.4 结核分枝杆菌在宿主中的生存机制15-16
• 1.2 CRISPR-Cas系统在基因敲入和基因干扰中的应用16-19
• 1.2.1 CRISPR-Cas系统与基因敲入17-18
• 1.2.2 CRISPR-Cas系统与真核细胞基因干扰18-19
• 1.3 双荧光指示系统与细胞自噬19-22
• 1.3.1 pH敏感型GFP19-20
• 1.3.2 串联蛋白GFPph-mCherry-LC3与自噬监视20-22
• 第二章 目的与意义22-23
• 第三章 材料与方法23-39
• 3.1 试验材料23-27
• 3.1.1 细胞、菌株、质粒及培养条件23
• 3.1.2 实验仪器及耗材23-24
• 3.1.3 主要的工具酶、抗体及试剂24-25
• 3.1.4 主要培养基、抗生素及其配置25-26
• 3.1.5 缓冲液及其配置26-27
• 3.1.6 主要的生物学分析软件27
• 3.2 试验方法27-39
• 3.2.1 结核分枝杆菌H37Ra及耻垢分枝杆菌mc2155感受态的制备27
• 3.2.2 结核分枝杆菌的电击转化27
• 3.2.3 sgRNA的设计及合成27-28
• 3.2.4 G418筛选浓度及维持浓度的确定28-29
• 3.2.5 Raw264.7 细胞的转染及后期筛选29
• 3.2.6 雷帕霉素诱导细胞自噬的分析29-30
• 3.2.7 CRISPRi/CRISPRa系统的构建30-31
• 3.2.8 细胞基因组的提取31
• 3.2.9 Western Blot实验31-32
• 3.2.10 以氯化钙法制备感受态细胞32-33
• 3.2.11 相关引物的设计及合成33-34
• 3.2.12 常规分子克隆实验34-39
• 第四章 技术路线39-40
• 第五章 结果和分析40-50
• 5.1 结核分枝杆菌H37Ra表达CFP菌株的构建与鉴定40-41
• 5.1.1 CFP重组表达质粒的构建40
• 5.1.2 H37Ra的BFP/CFP荧光表达菌株的鉴定40-41
• 5.2 双荧光巨噬细胞系的构建及验证41-46
• 5.2.1 G418工作浓度的筛选41-42
• 5.2.2 CRISPR相关剪切质粒的构建42
• 5.2.3 EGFP基因序列的改造42-43
• 5.2.4 同源重组片段的克隆43
• 5.2.5 稳定转染细胞系的构建及初步筛选43-45
• 5.2.6 细胞系GFPph-mCerry-LC3融合蛋白表达检测45
• 5.2.7 细胞系指示自噬的功能验证45-46
• 5.3 干扰自噬相关结核蛋白的筛选46-47
• 5.4 鼠源自噬基因gRNA文库的构建47-50
• 5.4.1 CRISPRi/CRISPRa系统功能验证47-48
• 5.4.2 相关鼠源自噬基因的筛选及gRNA设计48-50
• 第六章 讨论与结论50-53
• 6.1 青色荧光结核分枝杆菌的构建50-51
• 6.2 双荧光巨噬细胞系的构建51-52
• 6.3 结核蛋白Rv0847对自噬的干扰的初步研究52
• 6.4 结论52-53
• 参考文献53-63
• 致谢63

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