弓形虫TgPRMT5基因的克隆鉴定，细胞定位及功能初步分析

发布时间：2017-09-29 21:24

  本文关键词：弓形虫TgPRMT5基因的克隆鉴定，细胞定位及功能初步分析

  更多相关文章： 弓形虫 蛋白精氨酸甲基转移酶 甲基化修饰 弓形虫组蛋白

【摘要】：一.研究背景弓形虫是一种细胞内寄生的单细胞原虫,能够感染几乎所有温血动物的有核细胞。据估计全球约有1/3的人口受到弓形虫的威胁,某些地区血清阳性率甚至可高达80%。弓形虫是一类重要的机会性致病原虫。慢性感染弓形虫后,机体免疫力正常的宿主主要表现为无任何临床症状的隐性感染；而在一些免疫功能下降或受抑制的宿主如肿瘤患者、艾滋病人等的体内,“休眠”的虫体则会迅速增生繁殖,破坏宿主细胞而引起多器官、多脏器的损害,严重者可导致宿主死亡。若宿主孕期感染弓形虫,可导致流产、死胎、畸形等,幸存者也常遗留智能低下等严重后遗症。因此弓形虫也是一中分别广泛可引起人兽共患病的寄生原虫。弓形虫机会性致病的生物学基础是速殖子和缓殖子的相互转化。速殖子在宿主免疫系统或相关药物的作用下可转换为缓慢增殖的缓殖子,以包囊的形式长期潜伏于脑组织中。然而目前临床上治疗弓形虫病的药物如乙胺嘧啶、乙酰螺旋霉素、复方新诺明等或者细胞因子如IFN-γ、IL-2等,对包囊内的缓殖子却几乎没有杀灭作用。因此,阐明弓形虫速殖子和缓殖子相互转化的调控机制,可发现防治弓形虫病的新途径。弓形虫速殖子在转化为缓殖子的过程中,会发生形态和生理代谢的巨大改变,那么必然伴随有大量基因表达的变化。在高等生物中,这些变化通常是在转录水平调控的,然而有研究发现在顶复门寄生虫包括弓形虫与疟原虫其基因组中只有很少的转录因子序列,这提示,在这些顶端的真核生物中必然还存在着其他的调控途径。在真核生物中,表观遗传基因调控是一种重要的基因调控方式。而组蛋白这样一类与染色质紧密连接的小分子蛋白的翻译后的修饰更是一种重要的表观遗传基因调控方式。通过分析弓形虫基因组数据库发现弓形虫存在全套编码组蛋白及组蛋白修饰酶的基因序列。而近期Kami.Kim教授的团队对弓形虫组蛋白进行质谱分析发现,弓形虫组蛋白存在丰富的翻译后修饰现象如甲基化修饰与乙酰化修饰等。这些都说明组蛋白修饰调控基因表达在弓形虫中也起着极为重要的作用。精氨酸甲基化修饰是一种广泛存在于细胞质与细胞核中的蛋白翻译后修饰现象,随着近十年以来对其深入的研究,其重要地位越来越受到大家的重视。而催化此类反应的正是蛋白质精氨酸甲基转移酶(Protein arginine methyltransferases, PRMTs),它通过转移S-腺苷甲硫氨酸上的甲基进而对靶蛋白进行甲基化修饰。PRMTs主要分为2型,Ⅰ型可催化生产不对称二甲基,Ⅱ型形成对称二甲基。目前发现弓形虫基因组中存在编码5种PRMTs的基因序列,其中TgPRMT1可甲基化修饰弓形虫的Argonaute蛋白以及组蛋白H4R3,而TgCARM1通过修饰组蛋白H3R17可调节基因的表达进而影响到速殖子与缓殖子间的转化。剩下的TgPRMT3、TgPRMT5未见有相关研究报道。PRMT5属于Ⅱ型精氨酸甲基转移酶。在哺乳动物中,普遍发现PRMT5可甲基化修饰组蛋白H2A、H3、H4进而影响基因的转录调节。本文旨在,通过分析PRMT5在弓形虫中的生物学特点,探索它对弓形虫基因表达的影响。二.目的1.克隆鉴定弓形虫PRMT5全长基因片段,构建克隆载体PEASY-Blunt-Zero-PRMT5,并对比分析PRMT5在弓形虫速殖子与缓殖子中的表达水平；2.观察PRMT5在弓形虫速殖子与缓殖子中的亚细胞分布；3.检测TgPRMT5的酶学活性以及寻找其靶蛋白；4.观察TgPRMT5表达量的改变对弓形虫的影响。三.方法1.收集Pru株及RH-PRMT5-HAX3株弓形虫速殖子与缓殖子总RNA,以此为模板RT-PCR扩增PRMT5基因的全长片段,构建克隆载体PEASY-Blunt-Zero-PRMT5对PRMT5进行测序鉴定。并通过Real time-RT-PCR以及Western blotting检测PRMT5在弓形虫速殖子与缓殖子中的表达水平。2.以转基因虫株RH-PRMT5-HAX3中TgPRMT5蛋白C-末端的HA-标签为检测蛋白,采用间接免疫荧光方法观察TgPRMT5在弓形虫速殖子与缓殖子中的亚细胞分布。分别提取速殖子胞浆与胞核蛋白,并以Western blotting方法进一步验证实验结果3.利用HA-标签进行免疫沉淀实验收集RH-PRMT5-HAX3虫株中内源性TgPRMT5蛋白复合物。将此蛋白复合物进行质谱分析寻找TgPRMT5的靶蛋白4.提取弓形虫核蛋白,通过Western blot观察H4R3以及H3R26位点是否存在对称二甲基化修饰5. RT-PCR扩增TgH3与TgH4基因的全长片段,构建原核表达载体PET-32a-H3与PET-32a-H4。将这些重组表达载体转化BL21 (DE3)感受态细胞,使用IPTG进行诱导表达。采用Western blotting以及SDS-PAGE分析表达产物6.采用Ni-NTA纯化收集rTgH3蛋白7.以纯化收集的rTgH3蛋白与牛的核心组蛋白包括H2A、H2B、H3和H4为反应底物,S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,与收集内源性TgPRMT5进行体外甲基化实验,并通过Western blotting实验来检测最终结果8.构建质粒TUB-CAT-PRMT5,将其转染野生型RH株弓形虫以建立PRMT5表达量上调的模型.Real time-RT-PCR检测转染后虫株中PRMT5的表达水平。收集其总RNA进行表达谱分析,观察此模型中弓形虫基因表达的变化9.构建质粒pSAG1::CAS9-U6::sgPRMT5,将其转染野生型RH株弓形虫。尝试筛选出PRMT5基因沉默的阳性虫株。四.结果1. RT-PCR扩增了RH虫株与Pru虫株TgPRMT5基因并进行了测序鉴定,发现RH株此基因与数据库中GT1虫株同源性为100%,而Pru虫株的同源性为99%。2.通过RT-PCR及荧光定量PCR对比发现,PRMT5在弓形虫速殖子与缓殖子期均有表达,在同型弓形虫速、缓殖子间表达量有差异,缓殖子期表达量高于速殖子期。且在不同型虫株间表达量有巨大差异,RH株表达量约为Pru株80倍。3.采用抗HA. tag的抗体,IFA检测RH-PRMT5-HAX3虫株中TgPRMT5蛋白的亚细胞定位。结果发现,在速殖子期,TgPRMT5蛋白主要分布于细胞质中；而在缓殖子期,TgPRMT5蛋白则主要分布于细胞核中。分别提取速殖子的胞浆与胞核蛋白,采用Western blot检测,也得到了相同的结果,即在速殖子期,TgPRMT5蛋白主要分布于细胞质中。4.采用Western blot检测发现在弓形虫体内H3R26以及H4R3位点存在对称二甲基修饰。5.构建表达载体PET-32a-H3与PET-32a-H4,成功诱导了rTgH3与rTgH4蛋白的表达。并通过Ni-NTA纯化柱获得了rTgH3与rTgH4蛋白。6.通过免疫沉淀实验,收集了RH-PRMT5-HAX3虫株中的TgPRMT5蛋白复合物,质谱分析鉴定到了100多个蛋白,其中包括了可能是TgPRMT5作用底物的组蛋白H4、H2A以及一些转绿相关蛋白等7.体外甲基化实验发现,TgPRMT5可对H4R3与H3R26位点进行对称二甲基修饰。8.成功构建重组质粒TUB-CAT-PRMT5后,在野生型RH株弓形虫中建立了PRMT5表达量上调的模型。9.成功构建了用于敲除TgPRMT5基因的重组质粒pSAGl::CAS9-U6::sgPRMT5以及PRMT5同源片段质粒PBlue-PRMT5 up-DHFR-PRMT5 down。五.结论本研究首次对弓形虫中的TgPRMT5基因进行了克隆与鉴定。TgPRMT5在弓形虫速殖子与缓殖子中均有表达,无论是Pru虫株还是RH-PRMT5-HAX3虫株,其速殖子与缓殖子中该基因的表达量均均有差异,缓殖子期高于速殖子期。且RH-PRMT5-HAX3虫株的表达量明显高于Pru虫株(P0.0001)。TgPRMT5在弓形虫速殖子与缓殖子中的亚细胞定位有显著差异,速殖子期主要分布于细胞质,而缓殖子期则主要分布于细胞核内。该结果也提示TgPRMT5在弓形虫不同时期可能行使不同的功能,组蛋白可能是其修饰的靶蛋白之一。对弓形虫核蛋白进行甲基化检测后发现H4R3以及H3R26位点存在对称二甲基修饰,而体外甲基化实验,也证明了TgPRMT5可甲基化修饰组蛋白H4R3与H3R26位点,在TgPRMT5沉淀复合物的质谱分析中也鉴定到了组蛋白。以上结果均提示,在体内情况下,TgPRMT5可能对组蛋白H4R3与H3R26位点进行了甲基化修饰。TgPRMT5过表达模型的成功建立可为更深入研究其功能奠定基础。
【关键词】：弓形虫 蛋白精氨酸甲基转移酶 甲基化修饰 弓形虫组蛋白
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R382.5
【目录】：

• 摘要3-8
• Abstract8-17
• 前言17-21
• 第一章 实验材料与方法21-52
• 1 实验材料21-27
• 1.1 实验试剂及耗材21-22
• 1.2 TgPRMT5核酸序列22
• 1.3 虫株、细胞系及实验动物22
• 1.4 溶液22-26
• 1.5 主要仪器26-27
• 2 实验方法27-52
• 2.0 宿主细胞HFF的培养27
• 2.1 弓形虫Pru株缓殖子的收集与接种27-28
• 2.2 弓形虫Pru株速殖子的收集与接种28
• 2.3 弓形虫RH-PRMT5-HAX3虫株速殖子的体外培养28-29
• 2.4 弓形虫RH-PRMT5-HAX3虫株缓殖子的体外诱导29
• 2.5 PEASY-Blunt-Zero-PRMT5载体的构建29-34
• 2.5.1 PCR引物的设计29
• 2.5.2 总RNA提取29-30
• 2.5.3 总RNA去基因组处理30
• 2.5.4 目的基因PRMT5的RT-PCR扩增与纯化回收30-32
• 2.5.5 连接及转化32-33
• 2.5.6 阳性重组子的鉴定33-34
• 2.6 RT-Real Time PCR检测弓形虫速、缓殖子中PRMT5的表达量34-35
• 2.7 Westernblot检测PRMT5在RH-PRMT5-HAX3虫株速、缓殖子的表达水平35-36
• 2.8 PRMT5在RH-PRMT5-HAX3虫株的速、缓殖子中的亚细胞定位36-38
• 2.8.1 免疫荧光(IFA)检测PRMT5的亚细胞定位,步骤如下36-37
• 2.8.2 Western blotting验证PRMT5在速殖子中的亚细胞定位37-38
• 2.9 内源性PRMT5蛋白的收集38-40
• 2.10 PRMT5免疫沉淀复合物鉴定40-41
• 2.10.1 SDS-PAGE凝胶的银染色40
• 2.10.2 Western blotting分析PRMT5免疫沉淀符合物40-41
• 2.11 构建原核表运载体PET-32a-T巧3/ TgH441-42
• 2.11.1 Tg朋与TgH4基因全长片段的RT-PCR扩增及纯化回收41
• 2.11.2 PET-32a-TgH3/TgH4的构建41-42
• 2.11.3 阳性重组子PET-32a-TgH3/TgH4的筛选与鉴定42
• 2.12 重组质粒PET-32a-TgH3/TgH4在大肠埃希菌中的表达42-43
• 2.13 重组表达产物SDS-PAGE电泳43
• 2.14 表达产物考马斯亮蓝染色以及Western blot分析43
• 2.15 纯化收集重组表达蛋白43-44
• 2.16 PRMT5体外甲基化实验44-45
• 2.17 甲基化反应产物及弓形虫核蛋白Western blot分析45
• 2.18 TgPRMT5表达量上调模型的建立45-48
• 2.18.1 过表达载体TUB-CAT-PRMT5的构建45-46
• 2.18.3 质粒TUB-CAT-PRMT5及TUB-CAT中量提取46-47
• 2.18.4 重组质粒TUB-CAT-PRMT5及TUB-CAT转染RH株速殖子47-48
• 2.18.5 Real Time RT-PCR检测PRMT5表达量48
• 2.19 TgPRMT5表达量上调模型的建立48-52
• 2.19.1 重组质粒pSAG1：：CAS9-U6：：sgPRMT5的构建与鉴定48-49
• 2.19.2 PRMT5同源片段的构建49
• 2.19.3 重组质粒pSAG1：：CAS9-U6：：sgPRMT5转染RH株速殖子49-50
• 2.19.4 阳性克隆的筛选与鉴定50-52
• 第二章 实验结果52-73
• 1 弓形虫精氨酸甲基转移酶TgPRMT5基因的克隆、鉴定及其在速殖子与缓殖子期表达量的比较52-56
• 1.1 PRMT5基因的克隆与鉴定52-53
• 1.2 Real Time RT-PCR检测PRMT5基因在弓形虫速、缓殖子中的表达量53-55
• 1.3Westernblot检测TgPRMT5在RH-PRMT5-HAX3虫株速殖子与缓殖子中的表达水平55-56
• 2 PRMT5在弓形虫的亚细胞定位56-58
• 2.1 免疫荧光(IFA)检测PRMT5的亚细胞定位56-57
• 2.2 Western blot验证PRMT5在速殖子中的亚细胞定位57-58
• 3 PRMT5酶学活性检测58-66
• 3.1 弓形虫核蛋白对称二甲基化修饰位点的检测58-59
• 3.2 PRMT5免疫沉淀复合物鉴定59-60
• 3.3 rTgH3与rTgH4的重组表达与纯化60-65
• 3.4 PRMT5二甲基化修饰组蛋白H3与H465-66
• 4 TgPRMT5表达量上调或下调后对弓形虫的影响66-73
• 4.1 重组质粒TUB-CAT-PRMT5的构建66-67
• 4.2 PRMT5表达量上调模型中PRMT5表达量的检测67-68
• 4.3 质粒pSAG1：：CAS9-U6：：sgPRMT5的构建68-70
• 4.4 同源片段的构建70-73
• 第三章 结论与讨论73-76
• 全文总结76-77
• 参考文献77-82
• 硕士期间研究成果82-83
• 致谢83-84

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