山奈酚通过调控FoxO通路抑制氧化应激介导的间充质干细胞凋亡机制研究

发布时间：2017-10-13 07:49

  本文关键词：山奈酚通过调控FoxO通路抑制氧化应激介导的间充质干细胞凋亡机制研究

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【摘要】：目的:在体外构建氧化应激环境,探讨山奈酚(kaempferol)抑制骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)凋亡的作用,并进一步研究ROS/Fox O信号通路在过程中发挥的作用及其机制。方法:提取SPF级适龄健康SD大鼠骨髓,采用全骨髓贴壁法提取、培养、纯化BMSCs并进行扩增,倒置相差显微观察细胞形态变化,运用流式细胞技术检测BMSCs表面标志物。选择第3代BMSCs随机分成一下几组:A:空白对照组、B:H2O2处理组、C:山奈酚处理组、D:山奈酚+H2O2组,CCK8法检测各组细胞活力;利用流式细胞仪测定各组细胞凋亡情况及细胞内活性氧水平;进一步运用RT-PCR技术检测各组抗氧化基因(CAT)和DNA损伤修复基因(Gadd45a)表达水平,Western blot检测各组BMSCs中Fox O3a的表达。结果:对培养的细胞形态进行观察,3代细胞完全贴壁,形态为梭形或扁平形,均一,呈集落样、紧密排列生长,符合SD大鼠BMSCs特征;实验结果可知H2O2提高细胞氧化应激水平而诱导BMSCs发生凋亡,细胞活力与H2O2浓度呈依赖关系且其降低程度随H2O2浓度增加而增加,同时细胞凋亡明显增加;山奈酚在选定的范围浓度(2μM-10μM)预处理时,对细胞的生长没有抑制作用,还有适度的促进细胞增殖,保护细胞的作用,但继续加大环境中山奈酚浓度,显示其逆转效果无显著变化。表明山奈酚能够通过降低BMSCs氧化应激水平发挥对抗凋亡的保护作用。与此同时,与正常组相比,H2O2组诱导的BMSCs细胞活力明显降低,凋亡率显著增高,伴随着细胞内活性氧自由基水平明显增高,Fox O3a含量上调,CAT基因和Gadd45a基因水平的表达量明显增高,表现为生长阻滞;山奈酚的加入,明显降低上述蛋白及基因水平的表达,抑制了BMSCs凋亡和ROS对细胞的毒害作用。结论:在体外构建H2O2诱导的氧化应激状态下,BMSCs表现出凋亡样改变并与其环境浓度呈现一定的相关性;山奈酚通过抑制氧化应激导致的BMSCs凋亡来发挥作用;山奈酚能下调ROS/Fox O信号途径的表达,引起后者转录抗氧化基因(CAT)和DNA损伤修复基因(Gadd45a)水平降低,从而保护骨髓间充质干细胞免受氧化应激诱导的凋亡现象。本实验旨在探讨山奈酚对抗氧化应激引起的凋亡的机理提供了一定的实验参考依据,为干细胞移植联合药物来改善干细胞存活情况、提高移植修复效率提供一定的实验依据。
【关键词】：山奈酚 氧化应激 过氧化氢 FoxO基因 骨髓间充质干细胞 凋亡
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文缩略词表9-11
• 第1章 引言11-14
• 第2章 材料与方法14-29
• 2.1 实验材料14-18
• 2.1.1 实验动物14
• 2.1.2 主要实验试剂14-15
• 2.1.3 仪器及设备15-16
• 2.1.4 相关药物药剂的配制16-18
• 2.2 实验方法18-29
• 2.2.1 器材的准备18
• 2.2.2 BMSCs的分离、培养、纯化18-19
• 2.2.3 BMSCs相关鉴定19-20
• 2.2.4 H_2O_2凋亡浓度及时间选择20
• 2.2.5 山奈酚适宜浓度及时间选择20
• 2.2.6 实验分组20-21
• 2.2.7 流式细胞术检测21
• 2.2.8 RT-PCR及Western blot检测21-28
• 2.2.9 统计学处理方法28-29
• 第3章 结果29-38
• 3.1 BMSCs的形态学观察与相关鉴定29-31
• 3.1.1 BMSCs的形态学观察29
• 3.1.2 BMSCs生成曲线绘制29-30
• 3.1.3 BMSCs表面抗原鉴定30-31
• 3.2 不同浓度梯度下细胞活力比较31-33
• 3.2.1 H_2O_2对BMSCs活力的影响31-32
• 3.2.2 山奈酚对H_2O_2处理下BMSCs活力的影响32-33
• 3.3 各组流式细胞技术测量结果33-35
• 3.3.1 各组细胞调亡率33-34
• 3.3.2 各组细胞活性氧水平34-35
• 3.4 RT-PCR及Western blot技术测量结果35-38
• 3.4.1 FoxO3a、CAT、Gadd45a表达水平35-36
• 3.4.2 FoxO3a蛋白表达量及分布36-38
• 第4章 讨论38-41
• 4.1 BMSCs概述及特性38-39
• 4.2 氧化应激与BMSCs凋亡39
• 4.3 山奈酚抗BMSCs氧化凋亡功能39-40
• 4.4 山奈酚与ROS/FoxO/CAT(Gadd45a）信号及BMSCs氧化凋亡40-41
• 第5章 结论与展望41-42
• 5.1 结论41
• 5.2 展望41-42
• 致谢42-43
• 参考文献43-47
• 攻读学位期间的研究成果47-48
• 综述 活性氧诱导细胞凋亡的研究进展48-57
• 参考文献54-57

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本文编号：1023674