刚地弓形虫R0P18-R0P12复合基因疫苗对小鼠的免疫保护性研究

发布时间：2017-10-13 16:25

  本文关键词：刚地弓形虫R0P18-R0P12复合基因疫苗对小鼠的免疫保护性研究

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【摘要】：刚地弓形虫(Toxoplasma gondii,T.gondii)是一种专性细胞内寄生的原虫,能感染多种脊椎动物,包括鸟类及陆地上和海洋中的哺乳动物。弓形虫感染宿主后可引起视网膜病变、脑膜脑炎等病变,还可引起孕妇的流产、死产、畸形或先天性感染等。在纳虫空泡的形成和修饰过程中发挥重要作用的棒状体蛋白,可在某种程度上影响宿主细胞内弓形虫的增殖和毒力。本研究采用分子生物学方法构建了真核表达载体pVAX1-ROP18-ROP12,并将其转染人宫颈癌细胞(HeLa细胞),经逆转录PCR鉴定该重组质粒能在HeLa细胞内正常表达后,免疫BALB/c小鼠,通过检测免疫相关指标来评估该重组质粒对小鼠的免疫保护性。首先,根据已发表的弓形虫TgROP18和TgROP12基因序列分别设计引物。采用Trizol法提取弓形虫速殖子总RNA,并通过逆转录PCR(RT-PCR)获得TgROP18基因、TgROP12基因。经酶切、连接等步骤构建成pVAX1-ROP18-ROP12真核表达载体,并通过PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析进行鉴定。结果显示,Tg ROP18、TgROP12基因的RT-PCR扩增产物分别为1 662bp和711bp,pVAX1-ROP18-ROP12质粒的PCR扩增产物为2 373bp,酶切鉴定结果正确。测序结果与已报道的TgROP18基因序列的一致性为100%,与已报道的TgROP12基因序列的一致性为99%。表明已成功构建了真核表达质粒pVAX1-ROP18-ROP12。然后,将重组质粒pVAX1-ROP18-ROP12转染HeLa细胞,转染48小时后提取各组HeLa细胞的总RNA,经逆转录PCR检测重组质粒pVAX1-ROP18-ROP12在HeLa细胞内的表达情况,并大量制备重组质粒pVAX1-ROP18-ROP12。最后,将重组质粒pVAX1-ROP18-ROP12经肌肉注射免疫小鼠。同时设立单基因质粒组(pVAX1-ROP18质粒组和pVAX1-ROP12质粒组)、空质粒pVAX1组、PBS组和空白组。各组小鼠均间隔两周免疫一次,前后共免疫四次,末次免疫剂量加倍。每次免疫前与末次免疫后两周采集各组小鼠的血液,分离血清后测定抗体水平;在末次免疫后两周,每组无菌取6只小鼠脾脏并制成脾细胞悬液,接种于细胞培养板中,培养不同时间后取脾细胞培养物上清测定细胞因子水平;同时,对剩余小鼠进行弓形虫速殖子攻击感染,观察并记录各组小鼠的存活时间。结果显示,实验组小鼠的抗体水平和细胞因子水平随着免疫次数的增加而逐渐升高。末次免疫后,实验组的抗体水平和细胞因子水平明显升高,与其他组相比有统计学差异(P0.05)。弓形虫速殖子攻击感染后,与其它组比较,实验组小鼠存活时间明显延长(P0.05),表明复合基因质粒pVAX1-ROP18-ROP12能诱发更强的免疫应答,这将为ROP18-ROP12复合基因疫苗的深入研究提供资料。
【关键词】：刚地弓形虫 ROP18-ROP12复合基因 基因疫苗 免疫应答
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-10
• 缩略词表10-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-28
• 结果28-32
• 附图32-42
• 附表42-44
• 讨论44-48
• 结论48-49
• 参考文献49-55
• 综述 刚地弓形虫棒状体蛋白及其核酸疫苗的研究进展55-71
• 参考文献63-71
• 致谢71-72
• 个人简历72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 郭玲玲;王春苗;张进顺;张晓磊;贾晓晖;姜文静;刘楠;;刚地弓形虫ROP12蛋白的生物信息学分析[J];中国病原生物学杂志;2015年06期

2 郭玲玲;张晓磊;张进顺;贾晓晖;姜文静;王春苗;刘楠;朱晓波;;刚地弓形虫ROP18基因的克隆及生物信息学分析[J];中国病原生物学杂志;2015年05期

3 张晓磊;张丽骞;王春苗;姜文静;贾天军;郭玲玲;张进顺;;弓形虫ROP11核酸疫苗免疫保护作用的研究[J];中国病原生物学杂志;2014年10期

4 赵桂华;尹淑霞;尹昆;;弓形虫棒状体蛋白与宿主细胞互作的研究进展[J];中国血吸虫病防治杂志;2014年04期

5 徐颖;高琦;徐前明;朱兴全;;弓形虫棒状体颈部蛋白及棒状体蛋白研究的新进展[J];中国人兽共患病学报;2013年12期

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7 张晓磊;张进顺;朱晓波;王春苗;贾晓晖;贾天军;徐云鹏;高雪;;刚地弓形虫RH株ROP11基因的克隆与真核表达载体的构建[J];中国病原生物学杂志;2013年11期

8 许越;张莹光;徐丹;曹利利;王巍;魏峰;刘全;;弓形虫棒状体蛋白ROP18的原核表达及其免疫保护性研究[J];中国病原生物学杂志;2013年08期

9 赵焕阁;韦yN;黄用豪;梁丽娟;林映莹;谭光宏;;弓形虫ROP18基因原核表达载体的构建及表达[J];中国病原生物学杂志;2013年06期

10 王培园;李结;朱兴全;袁子国;;弓形虫基因工程疫苗研究的新进展[J];中国预防兽医学报;2013年03期

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本文编号：1025908