电压门控钙通道对衰老动物模型中骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

发布时间：2017-10-13 21:20

  本文关键词：电压门控钙通道对衰老动物模型中骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

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【摘要】：衰老性骨质疏松症是一类具有特定病理生理特点的老年性综合症:在增龄的影响下,生物体内骨小梁数量减少,骨质强度降低,骨量下降。衰老性骨质疏松症所导致的并发症如疼痛、骨折、呼吸困难等常常给患者带来很多困扰。伴随着全球老龄化的逐渐加剧,衰老性骨质疏松症的防治形势也日益严峻。对衰老的研究通常建立在衰老动物模型上,将小鼠金属蛋白酶24基因敲除(KO)会导致其产生早老的症状,因此这种小鼠是研究衰老的一个较为成熟的动物模型。骨髓间充质干细胞作为骨系细胞中的多能干细胞,其在骨骼代谢的过程中扮演了重要的角色。它具有多向分化的功能,使得新骨能够替换旧骨,进而能够维持骨组织自我更新的能力,是当前组织工程研究中的一大热点。然而,伴随着年龄的增加,BMMSCs的自我更新、多向分化等一系列生物学功能是否受到衰老影响产生障碍,其发展变化的内在分子调控机制尚不明确。多条信号通路调节控制了BMMSCs的成骨分化过程,钙离子信号转导通路尤其是L型电压门控钙通道与BMMSCs成骨分化关系密切。然而L型钙通道是否通过调节BMMSCs成骨分化导致衰老性骨质疏松的发生,尚未有文献报道。因此我们设计本实验来探索衰老小鼠BMMSCs钙信号通路的变化以及其对bmmscs成骨分化的影响,以期进一步揭开衰老性骨质疏松中bmmscs缺陷的内在机理。实验目的1.研究早衰小鼠骨量较野生小鼠的变化。2.研究早衰小鼠bmmscs成骨分化能力较野生小鼠的变化。3.研究早衰小鼠bmmscs钙信号较野生小鼠的变化。4.通过正负向调节l型电压门控钙通道探讨其对早衰小鼠bmmscs成骨分化能力的影响。实验方法1.分别取早衰转基因(zmpste24-/-)小鼠和野生型(wt)小鼠各3只,用micro-ct以360°、10μm的扫描分辨率对各小鼠的肱骨近端进行扫描,选择目标区域进行骨小梁三维图像重建,比较分析ko小鼠和wt小鼠骨体积分数、骨小梁数量以及骨密度的差异。2.取ko小鼠和wt小鼠各6只,脱颈处死后,贴壁法制取bmmscs原代,传至p3代,成骨分化诱导14天,分别用茜素红染色的方法观察ko小鼠和wt小鼠bmmscs矿化结节形成情况;用rt-pcr技术检测ko小鼠和wt小鼠bmmscs成骨分化相关基因的表达水平;用westernblot技术检测ko小鼠和wt小鼠bmmscs成骨相关因子的蛋白水平。3.用激光扫描共聚焦荧光显微镜检测ko小鼠和wt小鼠p3代bmmscs胞内钙离子的浓度差异;用rt-pcr技术检测ko小鼠和wt小鼠bmmscs内电压门控钙离子通道的表达特点,筛选出有差异的钙离子通道。4.在发现ko小鼠bmmscs表达钙离子通道cav1.2低于wt小鼠的基础上,以成骨诱导液加cav1.2钙通道抑制剂进行诱导培养的wt小鼠bmmscs为实验组,以成骨诱导液进行诱导培养的wt小鼠bmmscs为对照组。检测钙通道抑制剂对wt小鼠bmmscs成骨分化的影响;以过表达cav1.2钙通道的ko小鼠bmmscs为实验组,无特殊处理的ko小鼠bmmscs为对照组,成骨诱导培养14天后,检测过表达cav1.2对ko小鼠bmmscs成骨分化能力的作用。实验结果1ko小鼠和wt小鼠通过micro-ct检测发现:ko小鼠的肱骨干骺端骨质较wt小鼠稀疏。ko小鼠的骨体积分数(bv/tv)、骨小梁数量(tb.n)、骨密度(bmd)均低于wt小鼠,且差异有统计学意义,(p0.05)。2ko小鼠和wt小鼠的bmmscs经纯化培养后均呈细长多边形,且可贴壁生长;茜素红染色可见两种小鼠的bmmscs均有矿化结节形成;半定量分析结果显示ko小鼠的染色阳性颗粒数明显低于wt小鼠(p0.05);rt-pcr检测结果显示,ko小鼠bmmscs中成骨相关基因alp、runx2、opnmrna的表达水平明显低于wt小鼠(p0.05);westernblot结果显示,ko小鼠bmmscs中成骨相关因子alp、runx2、opn的蛋白表达水平亦均明显低于wt小鼠(p0.05)。3激光共聚焦显微镜检测显示,ko组bmmscs的钙荧光强度低于wt组,且差异具有统计学意义,(p0.05);rt-pcr检测结果显示,ko组bmmscs中钙离子通道cav1.1、1.2、2.1、2.2的表达水平均明显低于wt组(p0.05)。4茜素红染色结果可见wt小鼠cav1.2抑制组bmmscs矿化结节染色阳性颗粒数量明显低于对照组(p0.05);rt-pcr检测结果显示,cav1.2抑制组bmmscs中成骨相关基因runx2、opn的表达水平亦均明显低于对照组,(p0.05);westernblot结果显示,cav1.2抑制组bmmscs中成骨相关因子runx2、opn的蛋白表达水平亦均明显低于对照组(p0.05)。对ko小鼠bmmscs成功转染cav1.2后诱导其成骨分化,茜素红染色结果可见ko小鼠cav1.2过表达组bmmscs矿化结节染色阳性颗粒数明显多于对照组,(p0.05);rt-pcr检测结果显示,cav1.2过表达组bmmscs中成骨相关基因runx2、opn的表达水平亦均明显高于对照组(p0.05);westernblot结果显示,cav1.2过表达组bmmscs中成骨相关因子runx2、opn的蛋白表达水平均显著高于对照组(p0.05)。结论1.与wt小鼠相比,ko小鼠存在骨骼衰老的症状,表现为骨小梁数量、骨体积分数以及骨密度的下降;2.与wt小鼠bmmscs相比,ko小鼠bmmscs生物学性能发生了改变,表现为成骨分化能力的降低;3.KO小鼠BMMSCs的钙信号通路发生了改变,表现为胞内钙离子浓度下降以及Cav1.2钙通道表达减少;4.通过抑制Cav1.2和过表达Cav1.2,我们推测KO小鼠BMMSCs低表达L型电压门控钙离子通道Cav1.2导致其成骨分化能力下降。
【关键词】：电压门控钙通道 骨髓间充质干细胞 成骨分化 骨质疏松 早老症
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R-332;R580
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文献回顾17-26
• 一、衰老性骨质疏松症与衰老模型17-19
• 二、衰老性骨质疏松与BMMSCs的关系19-21
• 三、调节控制BMMSCs成骨分化的信号转导通路21-25
• 四、假说与研究背景25-26
• 实验一 金属蛋白酶24敲除（zmpste24~(-/-)）小鼠骨质特征的研究26-29
• 1 前言26
• 2 实验材料26
• 3 实验方法26-27
• 4 实验结果27-28
• 5 讨论28-29
• 实验二 Zmpste24KO小鼠和WT小鼠BMMSCs的培养和鉴定以及二者成骨分化能力的比较29-43
• 1 前言29
• 2 实验材料29-31
• 3 实验方法31-38
• 4 实验结果38-41
• 5 讨论41-43
• 实验三 Zmpste24KO小鼠与WT小鼠BMMSCs胞内钙离子浓度差异以及电压门控钙通道的表达检测43-48
• 1 前言43
• 2 实验材料43-44
• 3 实验方法44-45
• 4 实验结果45-46
• 5 讨论46-48
• 实验四 检测Cav1.2 对小鼠BMMSCs成骨分化能力的影响48-60
• 1 前言48
• 2 实验材料48-49
• 3 实验方法49-54
• 4 实验结果54-58
• 5 讨论58-60
• 小结60-61
• 参考文献61-67
• 个人简历和研究成果67-68
• 致谢68

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