JEV-YFV嵌合病毒作为黄热病毒疫苗的抗原性和免疫原性研究

发布时间：2017-10-14 01:27

  本文关键词：JEV-YFV嵌合病毒作为黄热病毒疫苗的抗原性和免疫原性研究

  更多相关文章： 黄热病毒 DNA-based双质粒系统 嵌合病毒

【摘要】：以乙脑疫苗株SA14-14-2的DNA-based复制子质粒和YF-17D prME基因为基础,构建新型人工JEV-YFV嵌合病毒,评价该嵌合病毒作为黄热病毒减毒活疫苗的抗原性和免疫原性。利用DNA-based双质粒系统,把SA14-14-2的prM-E基因用YF-17D的prM-E基因进行替换,构建SA14-14-2和YF-17D疫苗株的嵌合型cDNA克隆,转染细胞获得JEV-YFV嵌合病毒。采用噬斑法、鉴定实验、免疫学实验、动物实验等对获得的拯救病毒进行生物学特性研究和疫苗有效性评价。JEV-YFV嵌合型cDNA转染Vero细胞后,获得拯救病毒,病毒滴度达到1.39×107PFU/mL,噬斑呈现“针尖”样,与YF-17D噬斑大小形态相近,但略小于SA14-14-2产生的噬斑。血清学方法鉴定证实为乙脑／黄热病毒嵌合病毒,命名为rYJ。通过免疫学实验、神经毒性实验、攻毒等实验,发现rYJ和YF-17D对3-4周龄Balb/c小鼠均无神经外毒性,有相似的神经内毒性。rYJ免疫后小鼠血清抗体阳转率达到100%,中和抗体滴度达到1：40,与YF-17D基本相同,用100000 LD50 YFV进行攻毒,rYJ免疫组和YF-17D免疫组均达到100%的保护效力。rYJ嵌合病毒的成功构建进一步支持了SA14-14-2成为新型疫苗载体的可能性,作为YFV减毒疫苗株,其具有良好的的抗原性和免疫原性,但是出于疫苗安全性考虑,我们可以对病毒的包膜E区进行改造,进一步降低对戒奶小鼠的神经内毒性,研制比现用疫苗YF-17D毒性更小的新型疫苗。
【关键词】：黄热病毒 DNA-based双质粒系统 嵌合病毒
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392-33
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 英文缩略语表10-12
• 1 前言12-19
• 1.1 黄热病毒及其疫苗12-15
• 1.1.1 黄热病毒简介12
• 1.1.2 黄热病的免疫与治疗12-13
• 1.1.3 YF-17D疫苗的不良反应13
• 1.1.4 YF DNA疫苗13-14
• 1.1.5 灭活YFV疫苗14-15
• 1.1.6 YFV亚单位疫苗15
• 1.2 日本脑炎疫苗SA14-14-2及以其为骨架构建的嵌合疫苗15-16
• 1.2.1 SA14-14-2简介15
• 1.2.2 JEV-DENV2嵌合病毒疫苗15-16
• 1.2.3 JEV-TBEV嵌合病毒疫苗16
• 1.2.4 JEV-DENV4嵌合病毒疫苗16
• 1.3 病毒疫苗研究概况16-18
• 1.3.1 病毒减毒活疫苗16-17
• 1.3.2 病毒灭活疫苗17
• 1.3.3 病毒基因工程亚单位疫苗17
• 1.3.4 病毒嵌合疫苗17
• 1.3.5 病毒合成肽疫苗17-18
• 1.3.6 病毒核酸疫苗18
• 1.4 本研究的目的与意义18-19
• 2 实验材料与方法19-31
• 2.1 材料19-20
• 2.1.1 病毒19
• 2.1.2 质粒19
• 2.1.3 细胞19
• 2.1.4 实验动物19
• 2.1.5 培养基19-20
• 2.1.6 试剂20
• 2.2 实验方法20-31
• 2.2.1 YFV prME基因的钓取20-21
• 2.2.2 融合PCR获得JEV-YFV嵌合基因片段21
• 2.2.3 双质粒系统构建JEV/YFV嵌合型cDNA21
• 2.2.4 转染21-22
• 2.2.5 JEV-YFV嵌合型拯救病毒的鉴定22-27
• 2.2.5.1 噬斑试验22
• 2.2.5.2 拯救病毒的基因组序列鉴定22-25
• 2.2.5.3 拯救病毒的放大培养和传代25
• 2.2.5.4 间接免疫荧光25-26
• 2.2.5.5 IHC试验26
• 2.2.5.6 流式细胞仪检测拯救病毒26
• 2.2.5.7 Western blot26-27
• 2.2.5.8 拯救病毒生长曲线的绘制27
• 2.2.6 拯救病毒的体内活性鉴定27-28
• 2.2.6.1 rYJ在戒奶小鼠体内神经外毒性检测27
• 2.2.6.2 rYJ在乳鼠体内神经内毒性检测27
• 2.2.6.3 rYJ在戒奶小鼠体内神经内毒性检测27
• 2.2.6.4 拯救病毒戒奶小鼠脑内LD_(50)检测27-28
• 2.2.6.5 拯救病毒小鼠免疫试验28
• 2.2.7 血清中特异性抗体鉴定28
• 2.2.7.1 间接ELISA试验28
• 2.2.7.2 50%噬斑减少试验28
• 2.2.8 病毒血症检测28-29
• 2.2.9 小鼠细胞免疫试验29
• 2.2.9.1 脾细胞悬液的制备29
• 2.2.9.2 细胞因子IFN-γ检测29
• 2.2.10 小鼠攻毒试验29-30
• 2.2.11 统计学分析30-31
• 3 实验结果31-46
• 3.1 应用DNA-based双质粒系统构建JEV和YFV的嵌合cDNA31-34
• 3.1.1 构建策略31-33
• 3.1.2 重组嵌合cDNA鉴定33-34
• 3.2 嵌合重组病毒的鉴定34-41
• 3.2.1 获得嵌合重组病毒34-35
• 3.2.2 重组病毒的序列测定35-36
• 3.2.3 IHC36-37
• 3.2.4 间接免疫荧光试验37-38
• 3.2.5 Western blot38
• 3.2.6 流式细胞仪检测拯救病毒38-39
• 3.2.7 生长曲线39-41
• 3.3 重组嵌合病毒神经毒性检测与免疫原性试验41-46
• 3.3.1 rYJ神经外毒性试验41
• 3.3.2 rYJ神经内毒性试验41-42
• 3.3.3 病毒血症42-43
• 3.3.4 免疫小鼠YFV抗体的检测43
• 3.3.5 细胞免疫试验43-44
• 3.3.6 攻毒试验44-46
• 4 讨论与结论46-50
• 4.1 讨论46-49
• 4.2 结论49-50
• 参考文献50-53
• 致谢53

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