组蛋白乙酰转移酶MOF在细胞应激中的调控作用

发布时间：2017-10-20 14:52

  本文关键词：组蛋白乙酰转移酶MOF在细胞应激中的调控作用

  更多相关文章： 细胞应激 MOF HSF1 HSP90 核应激小体

【摘要】：细胞受到损害因素刺激(如基因毒性剂、高温、缺氧、活性氧增多、细菌或病毒感染等)时,会产生一系列防御或适应性反应,这些反应统称为细胞应激(Cellular Stress),细胞应激反应的最终目的是通过诱导一些基因表达的改变,使细胞对有害环境的抵抗能力或耐受性增加,得以在恶劣环境下存活。热休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)是细胞应激反应中参与细胞保护作用的主要应激蛋白,HSPs是一类细胞在高温(热休克)或其他应激原作用下所诱导生成或生成增加的蛋白质,这类蛋白广泛存在于各种细胞中并且高度保守。正常状态下,HSPs在细胞内也有表达,只是水平较低,负责维持细胞内环境的稳定状态。除了高温,其他的许多生物、化学及物理因素如：自由基、活性氧、炎性因子、射线等也会诱导HSPs表达量增高。HSPs的表达则是由细胞中一类叫热休克因子(Heat Shock Factors,HSFs)的小家族转录因子诱导的,HSFs与HSP基因的5’端启动子区的热休克应答元件(heat shock elements,HSEs)相互结合激活HSP基因的转录。HSFs家族由四个成员组成,包括HSF1、HSF2、HSF3和HSF4,其中HSF1是哺乳动物细胞中HSPs的主要转录调控因子。正常生理状态下,HSF1以单体形式与分子伴侣及共伴侣分子形成复合物呈现无活性的抑制状态,当各种应激因素刺激细胞时,HSF1从复合物中释放,经过一系列翻译后修饰,获得转录活性,并在细胞核内积累聚集,结合到热休克应答元件上,激活HSP基因的转录,诱导HSPs蛋白表达增加。MOF(也叫作KAT8或MYST1)是组蛋白乙酰基转移酶MYST家族的成员,可以特异地乙酰化组蛋白H4的第16位赖氨酸残基(H4K16ac),是胚胎发育及转录激活重要的调控因子。MOF在细胞的诸多生理活动过程中发挥着至关重要的作用,包括细胞增殖、分化、肿瘤发生及DNA损伤应答修复等。有研究表明,MOF可以直接结合到细胞周期调控所需基因的启动子激活它们的表达,细胞应激状态下,MOF是细胞应激响应转录调控网络的关键维持因子。因此,研究MOF与HSF1及HSPs在细胞应激中的关系及相互作用,有助于我们更深入的了解细胞应激响应机制。研究目的：利用紫外线交联仪照射细胞,基因毒性剂放线菌素D(ActD)、丝裂霉素C(MMC)处理细胞及42℃水浴热激细胞,建立细胞应激损伤模型,通过蛋白质印迹、细胞浆与细胞核蛋白抽提,细胞的免疫荧光染色,免疫沉淀等分子生物学、细胞生物学等检测方法,观察应激组与对照组相比MOF、HSF1、HSP90蛋白表达水平的变化,细胞内的定位及它们之间的相互作用关系,从而确定它们在细胞应激反应中的作用。研究方法：1.培养人乳腺癌MCF7细胞、结肠癌HCT116细胞、宫颈癌HeLa细胞,分为对照组和处理组,处理组进行相应的应激损伤处理；于相应的时间收集对照组和应激处理组细胞,收细胞之前观察一下细胞形态的变化；2.WesternBlotting检测MOF蛋白表达及H4K16ac水平,比较对照组及应激处理组MOF蛋白表达的变化及细胞形态的变化,从而确定MOF对处于应激状态下细胞的作用；3.干扰MOF表达,进行应激损伤处理,检测敲低MOF的细胞与正常细胞相比,细胞应激时细胞形态变化；4.在MCF7细胞中过表达MOF, MTT法检测细胞应激损伤处理后,与对照组相比,过表达MOF的细胞存活率的变化,进一步明确MOF在细胞应激响应中的作用；5.细胞浆蛋白与细胞核蛋白抽提与分离,检测MOF在细胞内的亚细胞定位及是否在细胞质与细胞核之间进行穿梭；6.细胞免疫荧光检测MOF、HSF1及HSP90的亚细胞定位及变化；7.Co-IP检测非应激状态及应激状态下MOF、HSF1、HSP90之间相互作用关系；7.用siRNA干扰的方法,干扰MOF的表达,然后用细胞免疫荧光染色检测敲低MOF时,与MOF正常表达的细胞相比,应激状态下HSF1及HSP90在细胞内的蛋白表达及亚细胞定位。实验结果：1. WesternBlotting结果显示发生细胞应激反应过程中,MOF蛋白表达水平升高,H4K16ac水平变化变化趋势与之相似,表明细胞应激损伤时,MOF会参与到损伤修复当中,损伤后期,MOF蛋白及H4K16ac水平降低,恢复到接近正常水平,同时在显微镜下观察到大量细胞死亡,并且敲低MOF的细胞与正常细胞相比死亡更为严重；2.MTT检测结果：过表达MOF的细胞与正常细胞相比,细胞应激反应后期存活率较高,进一步证实MOF参与到细胞应激反应过程中,过表达MOF可以增强细胞对应激损伤的的抵抗能力；3.细胞浆与细胞核蛋白抽提与分离结果表明,细胞应激时,MOF始终定位在细胞核中,并没有进行核质穿梭；4.细胞免疫荧光实验显示,细胞应激时,MOF会在细胞核内聚集,形成的核结构与热休克反应时HSF1形成的应激小体形态规则相似；5.HSF1与MOF或HSP90与MOF两种抗体进行细胞免疫荧光染色亚细胞定位,显示细胞应激时MOF、HSF1及HSP90会在核内聚集形成共定位的应激小体；6.Co-IP结果显示应激状态和正常生理情况下MOF与HSF1及HSP90之间都存在相互作用,而HSF1和HSP90只有在正常状态存在相互作用。7.敲低MOF不影响HSF1与HSP90蛋白水平,但会破坏细胞应激时它们在核内的聚集形成核应激小体。结论：MOF是应激反应中转录调控的重要调节因子,HSF1是核应激小体的标记并且可以转录激活参与细胞应激应答的基因,我们的研究结果证实MOF始终定位在细胞核内并且与HSF1及HSP90存在相互作用,细胞应激时MOF会协同HSF1和HSP90一起,聚集形成应激小体,参与应激响应、修复损伤。我们的研究有助于进一步理解细胞应激响应过程,深入阐明细胞损伤修复机制。
【关键词】：细胞应激 MOF HSF1 HSP90 核应激小体
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符号说明13-15
• 前言15-24
• 材料与方法24-33
• 实验方法33-43
• 实验结果43-53
• 讨论53-56
• 实验结论56-57
• 参考文献57-61
• 致谢61-62
• 发表学术论文62
• 参与研究课题62-63
• 附件63

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本文编号：1067765