人自噬相关基因LC3B原核表达载体的构建及活性检测

发布时间：2017-10-21 00:25

  本文关键词：人自噬相关基因LC3B原核表达载体的构建及活性检测

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【摘要】：目的构建带GST标签的人LC3B基因原核表达载体,得到GST-LC3B重组质粒并纯化出GST-LC3B融合蛋白,体外检测并证实该蛋白的生物学活性。方法利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出LC3B基因的编码序列,将该序列插入到p GEX-KG载体中,得到GST-LC3B重组质粒,转化大肠杆菌Rossate,经小量诱导后利用GSTSepharose 4B亲和珠纯化GST-LC3B融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western印迹方法进行检测,GST pull-down技术证实其生物学活性。结果利用PCR技术从人乳腺文库中成功扩增得到大小约400 bp的目的基因片段,插入p GEX-KG载体中得到GST-LC3B质粒,经双酶切鉴定及测序结果表明重组质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量(Mr)约为40×103的目的蛋白;GST pull-down技术检测出GST-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白在体外作用,具有较好的生物学活性。结论成功构建了人自噬相关基因LC3B的原核表达产物,为进一步研究LC3B在自噬中的作用机制奠定了基础。
【作者单位】： 解放军总医院第一附属医院;军事医学科学院生物工程研究所;
【关键词】： 人LCB基因 原核表达 纯化 自噬
【基金】：国家自然科学基金资助项目(31100604)
【分类号】：R392.12;Q78
【正文快照】： 自噬(autophagy)是真核生物细胞特有的一种自我降解、自我吞噬的生命现象[1]。自噬的实质是细胞的分解代谢[2],即在营养缺失、低氧或病原体感染等应激条件下,细胞依赖溶酶体对自身的大分子物质(如蛋白)、细胞器(如线粒体)等进行降解,以提供细胞生存代谢所需的能量和营养物质。

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本文编号：1070234