CHO细胞表达重组人绒毛膜促性腺激素性腺激素的调控机理研究

发布时间：2017-10-24 06:14

  本文关键词：CHO细胞表达重组人绒毛膜促性腺激素性腺激素的调控机理研究

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【摘要】：人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin, hCG)是由胎盘滋养细胞合成和分泌的一种双亚基糖蛋白激素,在治疗女性不孕、诱导排卵以及某些疾病的检测中起到重要的作用。传统hCG的生产方法是从孕妇尿中提取,但这种方法存在许多缺点,比如来源不受控制,纯化困难,批次间差异较大等,限制了hCG的临床使用。目前已有商品化的重组hCG (rhCG)上市,但由于对蛋白表达的调控机理缺乏了解,蛋白表达水平偏低。本文通过FLP-In定点整合系统筛选出了不同rhCG表达水平的稳定细胞株,并通过对不同表达水平细胞株的转录水平、翻译水平、组装折叠水平以及分泌水平的研究,揭示了rhCG蛋白表达的限制因素。 通过考察不同表达水平细胞株的mRNA丰度以及mRNA的稳定性和转录速率,以及通过ELISA检测方法检测不同表达水平细胞株的胞内胞外α亚基多肽、β亚基多肽以及完整hCG蛋白浓度,本文揭示了rhCG蛋白表达过程的各种限制因素：第一,不同表达水平细胞株β亚基的mRNA水平相对较高,这可能是rhCG蛋白表达所必需的,过量的β亚基合成可能能够促进rhCG的合成。进一步通过验证mRNA的稳定性和转录速率,证实了转录水平的差异并不是由于各亚基mRNA的稳定性差异引起的而是由于转录速率的差异引起的；第二,相比于β亚基的mRNA丰度,高表达细胞株中α亚基的转录水平存在明显限制；第三,在高表达细胞株中,无论是α亚基还是β亚基其从mRNA到多肽的合成步骤均存在明显限制,β亚基的限制尤其显著。这可能与β亚基的结构复杂性有关,β亚基比α亚基多一个链内二硫键和四个O糖链,细胞O糖链修饰能力的缺乏可能是导致这种限制发生的主要原因；第四,在本研究的rhCG蛋白表达水平下,蛋白在组装和分泌水平均不存在明显限制。 本文提出了一种双亚基蛋白表达调控机理研究的方法,揭示了rhCG蛋白表达过程的限制因素,对于构建高表达的rhCG工程细胞株具有重要的指导意义。
【关键词】：细胞培养 人绒毛促性腺激素(hCG) 表达调控机理
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 文献综述10-23
• 1.1 人绒毛膜促性腺激素10-12
• 1.1.1 人绒毛膜促性腺激素的简介10-11
• 1.1.2 人绒毛膜促性腺激素的临床作用11
• 1.1.3 人绒毛膜促性腺激素的生产方法简介11-12
• 1.2 哺乳动物细胞表达系统生产重组蛋白药物12-14
• 1.2.1 国内外重组蛋白药物的发展进程12
• 1.2.2 中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达系统12-14
• 1.3 定点整合系统筛选稳定表达细胞株14-17
• 1.3.1 FLP-In定点整合系统的简介14-17
• 1.3.2 FLP-In定点整合系统的优点17
• 1.4 实时荧光定量PCR17-19
• 1.4.1 实时荧光定量PCR的简介17-18
• 1.4.2 实时荧光定量PCR的相对定量18-19
• 1.4.3 实时荧光定量PCR的绝对定量19
• 1.4.4 实时荧光定量PCR技术的应用19
• 1.5 外源基因在哺乳动物细胞表达过程中限制因素的研究19-21
• 1.5.1 载体设计、质粒整合和染色体环境20
• 1.5.2 mRNA的稳定性和加工处理20-21
• 1.5.3 蛋白质的翻译和分泌21
• 1.6 研究内容与研究意义21-23
• 第2章 人绒毛膜促性腺激素表达载体的构建23-40
• 2.1 前言23
• 2.2 实验材料23-24
• 2.2.1 菌株和质粒23
• 2.2.2 培养基和溶液23-24
• 2.2.3 主要试剂、试剂盒、仪器设备及分析软件24
• 2.3 实验方法24-31
• 2.3.1 菌种培养和保藏24
• 2.3.2 质粒抽提步骤24-25
• 2.3.3 琼脂糖凝胶回收步骤25
• 2.3.4 DH5α大肠杆菌感受态细胞的制备步骤25-26
• 2.3.5 DH5α感受态细胞的转化26
• 2.3.6 包含两个PCMV-BGHpA表达框的pcDNA5/FRT载体构建26-28
• 2.3.7 含有α亚基的pcDNA5/FRT(2)-α载体的构建28-30
• 2.3.8 含有α亚基和β亚基的pcDNA5/FRT-hCGαβ载体的构建30-31
• 2.4 实验结果31-39
• 2.4.1 包含两个PCMV-BGHpA表达框的pcDNA5/FRT载体构建31-35
• 2.4.2 含有α亚基的pcDNA5/FRT(2)-α载体构建35-37
• 2.4.3 含有β亚基的pcDNA5/FRT-hCGαβ载体构建37-39
• 2.5 小结39-40
• 第3章 FLP-In定点整合系统和流式细胞仪细胞分选技术的建立40-47
• 3.1 前言40
• 3.2 实验材料40-42
• 3.2.1 细胞株、质粒40-41
• 3.2.2 培养基和溶液41
• 3.2.3 实验试剂和仪器41-42
• 3.3 实验方法42-43
• 3.3.1 细胞培养42
• 3.3.2 质粒转染42
• 3.3.3 流式细胞仪检测细胞的转染效率42
• 3.3.4 FLP-In定点整合系统宿主细胞株的筛选42-43
• 3.3.5 FLP-In定点整合系统表达细胞株的筛选43
• 3.4 实验结果43-45
• 3.4.1 FLP-In定点整合系统宿主细胞系筛选转染效率的测定43-44
• 3.4.2 流式细胞仪分选细胞44-45
• 3.5 小结45-47
• 第4章 CHO细胞表达rhCG蛋白的表达调控机理研究47-59
• 4.1 前言47
• 4.2 实验材料47-48
• 4.2.1 细胞株、培养基47
• 4.2.2 实验试剂和仪器47-48
• 4.3 实验方法48-52
• 4.3.1 总RNA抽提和hCG mRNA的测定48-49
• 4.3.2 hCG各亚基mRNA稳定性分析49
• 4.3.3 实时荧光定量PCR绝对定量标准品的制备49-50
• 4.3.4 转录速率分析50-51
• 4.3.5 ELISA方法检测hCG各亚基和完整hCG蛋白的浓度51-52
• 4.4 实验结果52-57
• 4.4.1 不同表达水平细胞株各亚基mRNA水平的比较52-53
• 4.4.2 不同表达水平细胞株各亚基mRNA稳定性的比较53-54
• 4.4.3 不同表达水平细胞株转录速率的比较54-55
• 4.4.4 不同表达水平细胞株胞内胞外α亚基多肽和β亚基多肽水平的比较55-56
• 4.4.5 不同表达水平细胞株胞内胞外完整rhCG蛋白浓度的比较56-57
• 4.5 小结57-59
• 第5章 总结与展望59-61
• 5.1 总结59
• 5.2 主要创新点59-60
• 5.3 展望60-61
• 参考文献61-68
• 致谢68

【共引文献】

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1 罗爱月;杨书红;沈薇;丁婷;赖志文;王毅;卢运萍;王世宣;;卵巢催乳素受体mRNA在小鼠卵泡发育及排卵过程中的表达[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2010年04期

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5 倪娟;李珍;薛京伦;汪旭;;表没食子儿茶素没食子酸酯对人成淋巴细胞株hMLH1和hMSH2 mRNA表达的影响[J];癌变·畸变·突变;2013年04期

6 郑旭青;代天星;林晓敏;熊浩;杨海弟;;KCNJ10通道蛋白在C57BL/6J小鼠耳蜗的年龄相关性表达及与听力关系[J];中国耳鼻咽喉头颈外科;2013年08期

7 文惠方;蒋春梅;张尚弟;车团结;黄超杰;赵峰;;宫腔脱落细胞中p53、ki-67、bcl-2、bax基因的表达及意义[J];中国妇产科临床杂志;2013年05期

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10 李欣;徐波;;中等强度耐力运动对心脏局部Ang II及AT_1R表达的影响[J];北京体育大学学报;2013年08期

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1 赵海霞;Ying Li;Yuzhong Wang;Jing Zhang;Xiaoming Ouyang;Renxiu Peng;Jing Yang;;蜈蚣糖肽抗肿瘤和免疫调节活性的研究(英文)[A];第十一届全国博士生学术年会（生物医药专题）论文集（上册，大会报告）[C];2013年

2 王志刚;严志;章必成;饶智国;余丽芳;刘健;高建飞;;基于芯片数据的随机森林算法鉴定结肠癌生物标记物(英文)[A];第四届湖北省抗癌协会青年委员会学术交流会论文集[C];2012年

3 任广睦;赵晋芳;梁新华;黄新宇;;死亡人体胸肌组织中rRNA亚基的稳定性[A];全国第九次法医学术交流会论文集[C];2013年

4 姜建萍;徐日福;范贤聪;张英英;刘强;杨雨江;;大骨鸡FSHβ与PIT1基因多态性及其聚合基因型对产蛋性能的影响[A];中国畜牧兽医学会家禽学分会第九次代表会议暨第十六次全国家禽学术讨论会论文集[C];2013年

5 Ruiwen Fan;Shanshan Yang;Zhanquan Shi;Kaiyuan Ji;Xiaoyun Jia;Jianbo Yao;George W Smith;Changsheng Dong;;Identification of a novel miRNA important for melanogenesis in alpaca(Lama Pacos)[A];2013中国驼业进展[C];2013年

6 郭翔羽;刘璇;徐仙洲;吴蒙;张旭;李强;刘文娇;张毅;王雅春;俞英;;牛DNA甲基转移酶3a/3b基因(DNMT3a/3b)的表达对肉质性状的影响[A];《第八届中国牛业发展大会》论文集[C];2013年

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8 Huang Qiang;Gong Yuehua;Wei Anqing;Peng Xiaoling;;Effects of hBD-3 on Staphylococcus aureus biofilm formation-regulating genes dltB and icaA genes[A];江西省第八次中西医结合危重病、急救医学学术研讨会论文集[C];2013年

9 田，

本文编号：1087422