VNN1调节炎症状态下的肝脏Hepcidin表达及肝铁紊乱的分子机制

发布时间：2017-11-06 19:04

  本文关键词：VNN1调节炎症状态下的肝脏Hepcidin表达及肝铁紊乱的分子机制

  更多相关文章： VNN1 Hepcidin 炎症 铁代谢

【摘要】：铁代谢紊乱是一种常见的疾病,与炎症、糖尿病、心血管等代谢性疾病息息相关,严重影响着人们的生活质量。因此,深入研究机体铁代谢的精密调控显得尤为重要。Hepcidin是一种肝脏合成并分泌的抗菌多肽,富含半胱氨酸,它在调控机体铁稳态中起着关键性作用。简单地说,机体内的Hepcidin可以与位于巨噬细胞和肠细胞的细胞膜表面的Ferroportin1 (FPN1)蛋白结合,进而将其内化和降解。由于FPN1是胞内铁输出的唯一通道,所以,Hepcidin可以通过调节FPN1来调控机体铁运输。机体内Hepcidin的水平处于动态平衡中,如果这个平衡被打破,会导致铁的缺乏或过载,从而引发一系列疾病。因此,维持机体Hepcidin的动态平衡就变得至关重要。研究表明,Hepcidin的表达受多种因素的调节,如机体的铁水平、炎症和缺氧。除此以外,人类许多代谢性紊乱疾病也与Hepcidin的紊乱密切相关,如遗传性血色素沉着病(hereditary hemochromatosis, HH)、炎性贫血(anemia of inflammation, AI)、慢性肾病(chronic kidney diseases)等。临床数据显示,在慢性炎症病人体内Hepcidin的表达比健康人群要高,从而引发炎性贫血。对于这方面的机制研究,目前仅停留在炎性因子IL-6可通过STAT-3 (signal transduction and activator of transcription-3)信号通路增加Hepcidin的表达,但哪些媒介物传递炎症信号来调控肝铁稳态尚未知晓。VNN1是一种在肠和肝脏组织中高表达的GPI-锚定蛋白质,具有泛酰巯基乙胺酶的活性。该酶水解泛酰巯基乙胺(pantetheine)形成巯基乙胺(pantothenic acid, vitamin B5)和半胱胺(Cysteamine)。研究表明,半胱胺(Cysteamine)在体内通过巯基二硫化物的交换反应生成氧化形式的胱胺(Cystamine),而胱胺正是许多重要代谢途径的关键调节因子。实验证明,VNN1全身性敲除的小鼠能抵抗2,4,6-三硝基苯磺酸基酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)造成的大肠炎。然而,令人惊奇的是,用胱胺处理上述小鼠可以完全逆转这种保护机制。综合前人的研究结果,我们不难发现炎症信号、VNN1及Hepcidin之间似乎存在着某种联系,因此,本文主要探究在炎症状态下,VNN1调节肝脏Hepcidin表达及肝铁稳态的分子机制。本文主要采用功能获得(gain-of-function)和功能缺失(loss-of-function)的过表达和干扰的方法。在细胞水平研究炎症状态下,VNN1调节Hepcidin表达及其分子机制。运用VNN1腺病毒和小干扰RNA siVNN1介导的过表达和干扰技术,采用实时定量PCR和Western Blot分析VNN1对Hepcidin表达的影响。同时,运用普鲁士蓝染色的方法分析肝铁堆积情况。在分子机制层面,我们检测了NF-κB的活性变化。随后,运用荧光素酶报告基因检测(Luciferase reporter assay)实验,研究VNN1调控hepcidin基因启动子的转录活性的机制。我们的研究结果证明,在小鼠的原代肝细胞中,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)能显著性地上调VNN1和Hepcidin的表达水平,该结果暗示了VNN1可能在LPS调控Hepcidin表达的过程中发挥着潜在的作用。过表达VNN1浓度梯度依赖性地增加Hepcidin的表达和肝铁堆积,而干扰VNN1出现相反的效果。上述结果表明,VNN1和Hepcidin的表达水平呈正相关性。最重要的是,干扰VNN1有效地拮抗LPS诱导Hepcidin的表达及肝铁紊乱。在分子机制层面上,NF-κB作为经典的信号通路参与调控炎症反应,同时,近年报道也表明在hepcidin基因启动子的-509 bp有一个NF-κB的结合位点,可以激活hepcidin基因的转录,所以,我们推测VNN1可能是通过激活NF-κB的活性在转录水平调控hepcidin基因的表达。我们通过细胞免疫荧光实验表明VNN1激活NF-κB的核转位。此外,BAY 11-7082 (NF-κB的抑制剂)处理能部分削弱过表达VNN1对Hepcidin的上调效果。普鲁士蓝染色的结果也验证了上述结果。细胞免疫荧光实验进一步说明NF-κB参与VNN1调控Hepcidin表达的过程。而干扰VNN1也能部分缓解LPS对NF-κB的激活效果。荧光素酶报告基因检测实验表明,干扰VNN1有效地抑制LPS对hepcidin基因启动子的激活作用。另一方面,我们的实验中VNN1的水解产物半胱胺(Cysteamine)的氧化形式胱胺(Cystamine)完全逆转干扰VNN1对Hepcidin表达的抑制作用,进一步证明了VNN1确实在调节肝脏Hepcidin的表达和维持肝铁稳态过程中起着关键性的作用。综上所述,我们的研究充分证明,在细胞水平上,VNN1增加肝脏Hepcidin的表达及肝铁堆积,而NF-κB的核转位在该现象中发挥着重要的作用。此外,VNN1的水解产物之一半胱胺也参与此过程。我们的研究首次探讨了细胞膜锚定蛋白VNN1、 Hepcidin及肝铁堆积之间的关系,并从分子机制层面对其进行了深入的研究,丰富了现有VNN1的功能,并进一步完善了Hepcidin调节肝铁稳态的理论认知,同时为从不同角度治疗炎症相关的肝铁紊乱的代谢性疾病提供了新的理论依据和药物靶点。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R363

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