Cohn组分Ⅳ中结合珠蛋白的纯化与鉴定

发布时间：2017-12-14 12:27

  本文关键词：Cohn组分Ⅳ中结合珠蛋白的纯化与鉴定

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【摘要】：结合珠蛋白(haptoglobin, Hp),又称触珠蛋白,是血清α2球蛋白组分中的一种酸性糖蛋白,主要由肝脏合成。它最主要的功能是与游离的血红蛋白(hemoglobin, Hb)结合并促进其从循环系统清除,从而避免对肾脏的损伤。早在20世纪50年代,人们就开始了以血浆为原料分离纯化结合珠蛋白的研究。然而,纯化效率低、成本高影响结合珠蛋白的规模化制备。1985年,结合珠蛋白浓缩制剂在日本上市,用于急性溶血状态下一般性治疗或者预防性使用,包括烧伤、烫伤、输血、体外循环心脏直视术等引起的溶血反应伴血红蛋白血症或血红蛋白尿,以及手术干预前的预防性使用等。但是,到目前为止,欧洲、美国和中国尚无结合珠蛋白产品批准用于临床。本研究以血浆蛋白生产过程中的废弃物Cohn组分Ⅳ为起始原料,探索适于规模化制备结合珠蛋白的工艺。研究内容主要包括以下五部分：首先,采用SDS-PAGE、免疫印迹及质谱分析的方法证明了结合珠蛋白的确存在于Cohn组分Ⅳ中,明确了其多聚体在非还原性SDS-PAGE中的位置主要位于245kD附近,为后续分离纯化结合珠蛋白工艺的探索奠定基础。其次,本文重点从前处理和层析精制两方面探索分离纯化结合珠蛋白的工艺。前处理工艺中,根据Cohn组分Ⅳ中目的蛋白及主要杂蛋白(白蛋白、仪1抗胰蛋白酶、转铁蛋白等)的分子结构及特性,分别采用PEG沉淀法、硫酸铵沉淀法、利凡诺-盐析组合法三种方法进行前处理,通过对比分析具体数据,结果表明利凡诺-盐析组合法是较为可取的方法,该方法能够有效去除杂蛋白,以白蛋白等小分子杂蛋白去除效果明显,并使目的蛋白富集,使后续层析效果达到最佳,是一种简单、有效的前处理方法,适用于规模化的前处理过程。层析分离工艺中,本研究探索三种不同的介质(DEAE-Sephrose Fast Flow、QMA Spherosil M、Q-Sepharose Fast Flow)分别在不同pH条件下分离纯化结合珠蛋白的效果。综合比较发现,采用Q-Sepharose Fast Flow层析的分离方法,SDS-PAGE显示其纯度较好,且目的蛋白损失相对较少。此外,采用利凡诺-盐析的前处理方法对结合珠蛋白进行粗纯,利用Q-Sepharose Fast Flow层析在pH5.5条件下实现对目的蛋白的分离,对工艺整体进行适当放大,结果表明工艺整体较为稳定。最后,利用Native-PAGE方法测的采用该工艺小试和适当放大后分离得到的目的蛋白的血红蛋白结合活性分别为2.8U/mL(10mg/mL)、3.75U/mL (15mg/mL)。采用免疫印迹及质谱分析进一步证明该方法成功分离得到目的蛋白。本研究以血液制品生产中的废弃物Cohn组分Ⅳ为起始原料,探索分离纯化结合珠蛋白的前处理及层析精制工艺,初步建立了利凡诺络合-盐析-Q-Sepharose Fast Flow离子交换层析分离纯化结合珠蛋白的工艺,该工艺简单,易于放大生产,具有较好应用前景。本研究为人结合珠蛋白的分离纯化提供可参考借鉴的数据,为建立更加简便经济适用的结合珠蛋白生产工艺奠定了基础。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392

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本文编号：1287901