真核表达载体pEGFP-C2-GATA-4的构建及其在P19细胞中的表达

发布时间：2017-12-30 02:24

  本文关键词：真核表达载体pEGFP-C2-GATA-4的构建及其在P19细胞中的表达　出处：《河北医科大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 目的:移植不同来源的干细胞以修复梗死的心肌组织、改善心功能已成为目前研究的热点。虽然人们已成功地将非心源性的干细胞(如胚胎干细胞、造血干细胞和骨骼肌卫星细胞等),移植至梗死的心肌区域并观察到它们分化成心肌样细胞,但是对于这一横向分化的具体机制所知甚少。目前移植技术的发展,体内外调控干细胞向心肌定向分化的因素和作用机制的探讨均提示:通过移植干细胞再生心肌以治疗心肌梗死疾病已经具有一定的理论基础而且拥有广阔的应用前景。目前尚需进一步研究明确干细胞向心肌细胞的定向分化调控因素与机制,以提高干细胞的心肌分化,加速干细胞安全可靠地应用于临床。 GATA-4是胚胎期心脏发生发育过程中起重要作用的转录因子,参与心脏前体细胞的分化、心脏的环化、房室分隔、传导系统及成熟心脏正常功能的维持。GATA-4主要通过其特有的锌指结构在胚胎发育过程中发挥重要作用,当GATA-4基因发生缺失或突变时就会引起各种心脏疾病。GATA-4因子是心脏前体细胞的最早期标志之一,对于心脏发育是必不可少的。GATA-4因子首先在心前期中胚层中表达,随后在心内膜和心肌中表达。GATA-4因子调节心肌细胞的发生、分化以及心肌前体细胞形成线状心管。GATA-4的表达对心肌细胞标志物的转录和表达至关重要。P19胚胎癌细胞(embryonal carcinoma cells,EC)经诱导可分化为包括心肌在内的多种细胞,在P19细胞向心肌分化的过程中,其细胞发育相关基因的表达及电生理特性与正常小鼠心肌发育过程相似,且该细胞易于进行基因操作,是研究心肌细胞发育的良好体外模型。 为进一步研究转录因子GATA-4在心脏发育及心肌分化中的作用,本研究构建了含有小鼠GATA-4编码框的pEGFP-C2-GATA-4真核表达载体,并在P19细胞中瞬时表达成功,为进一步研究心特异转录因子的功能及调控机制奠定基础。 方法: 1以真核表达质粒pEFSA-GATA-4为模板,PCR扩增得到小鼠GATA-4基因片段,将目的片段亚克隆到pEGFP-C2载体,卡那霉素筛选阳性克隆,经菌落PCR、酶切鉴定和测序鉴定正确。2将重组质粒pEGFP-C2-GATA4以脂质体法瞬时转染P19细胞,以免疫细胞化学、共聚焦扫描显微镜、PCR、免疫印记法检测GATA-4-EGFP融合蛋白在P19细胞中的表达。 结果: 1经PCR获得1325bp的产物,经酶切、DNA测序,确定所扩增片段为GATA-4基因cDNA,进而成功筛选出表达载体pEGFP-C2-GATA-4。2转染后的P19细胞中通过免疫细胞化学,RT-PCR,Western blot等方法分别从基因和蛋白水平证明P19细胞中有GATA-4基因的表达。 结论:获得编码GATA-4的基因片段,并成功构建了其真核表达载体pEGFP-C2-GATA-4。在其转染的P19细胞中有GATA-4基因表达。GATA-4基因cDNA真核表达载体的成功构建以及在P19细胞中的表达的特点显示了极具意义的潜在应用价值。心脏发育的转录调控是个极其复杂的过程,是一个多种转录调控因子参与的联合协同运作的网络系统,而GATA-4因子在其中扮演关键的角色。GATA-4因子不仅调控心脏结构基因的表达,而且还调控许多其它转录调控因子的表达。由GATA-4因子出发我们可以绘制出一份复杂的心脏发育转录调控网络,不仅可以增进我们对心脏发育分子调控机制的认识,还可以增进对心脏疾病发病机制的认识,使心脏疾病早期干预和基因治疗成为可能,为根治心脏疾病提供了一条切实有效的途径。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R346

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本文编号：1352944