小鼠胚胎干细胞建系及人胚胎干细胞培养体系的建立初探

发布时间：2017-12-30 04:11

  本文关键词：小鼠胚胎干细胞建系及人胚胎干细胞培养体系的建立初探　出处：《浙江大学》2005年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)是从植入前的胚胎内细胞团(Inner mass cells,ICM)或原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)分离和克隆的 具有多潜能性细胞。胚胎干细胞的发现为研究细胞分化,动物和人发育机制,阐 明基因功能,筛选药物,细胞治疗疑难杂症等开辟了广阔的空间。胚胎干细胞的 建系工作,是任何干细胞研究的基础。优良的建系方法和稳定的培养体系,为后 期各种实验铺垫了道路。本实验进行了大量的方法和技术上的探索,旨在建立小 鼠和人胚胎干细胞系。 实验首先用磷酸钙共沉淀法将质粒pEGFP-N2导入小鼠胚胎干细胞D3细 胞系中,在荧光显微镜下以488nm激发光检查阳性克隆,并进行初步扩增。经 G418筛选后,机械挑取EGFP强阳性表达的克隆,并在丝裂霉素C处理的小鼠 胚胎成纤维细胞的饲养层上进一步扩大培养,获得纯化的转染细胞系。20代以 后,转染细胞仍然表达绿色荧光蛋白。PCR检测表明8代和18代转染细胞均携 带有GFP标志基因。对稳定表达EGFP的干细胞系进行碱性磷酸酶染色、拟胚 体和畸胎瘤形成的检测,证明这些细胞具有干细胞的特征。经过拟胚体阶段,可 进一步分化成具有搏动能力的心肌细胞,分化百分率为30-40%,较未转染细胞 60-70%的分化率低。 这些细胞在激光共聚焦显微镜下呈绿色荧光,免疫组化染 色显示具心肌细胞特异的cTnT分子标志。该EGFP标记的干细胞系带有可进行 原位、实时检测的绿色荧光,可应用于细胞移植和体内分化的研究。 实验第二部分选取超排后129 S1/SvImJ品系小鼠的优质囊胚,使用辐照后 冻存复苏的小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,对比高浓度酶短时间消化法和低浓 度酶长时间消化法,以0.25%胰酶-0.04%EDTA高浓度酶短时间消化法高效建立 了4株小鼠胚胎干细胞系,建系率为36.3%。碱性磷酸酶,核型分析,体外分化 和体内分化能力以及小鼠胚胎干细胞表面特异性分子标志Oct-4和Nanog的检测 等表明,4个MES细胞系均为典型的小鼠胚胎干细胞系。所建立的MES细胞系 为大规模培养MES细胞,进行后续的实验建立了理想的材料平台。 实验第三部分进行了人胚胎干细胞培养体系的初步探索,通过对培养液,血 清,血清替代物,以及各种生长因子的调配,以及饲养层状态的调节,成功建立
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R321

【引证文献】

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1 李三华;昆白小鼠胚胎干细胞的分离、培养及鉴定[D];西北农林科技大学;2006年

2 张以涛;小鼠乳腺上皮细胞培养体系的建立及初步应用[D];东北农业大学;2007年

3 苏敏;顺铂诱导小鼠胚胎干细胞毒性相关基因的筛选及其初步分析[D];天津医科大学;2012年

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本文编号：1353259