双歧杆菌对内毒素损伤幼年大鼠肠道保护机制的研究

发布时间：2018-01-01 02:34

本文关键词：双歧杆菌对内毒素损伤幼年大鼠肠道保护机制的研究　出处：《中国医科大学》2007年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 双歧杆菌对内毒素损伤幼年大鼠肠道保护机制的研究前言消化道是机体内最大的免疫组织，因此消化道的黏膜完整性和功能状态对维护整个机体的健康状况有重要作用，同时消化道又是人体最大的细菌库，危重病人因禁食、使用抗生素或制酸剂等因素，可破坏肠道内微生态稳定性，由此引起的肠道菌群失调已成为细菌移位及肠源性感染的最主要原因。肠黏膜屏障可分为机械屏障(肠上皮分泌的黏液、肠上皮细胞及其紧密连接等)、生物屏障(双歧杆菌、乳酸杆菌等)、化学屏障(NO、肠腔内pH值等)和免疫屏障(消化道相关淋巴组织GALT、吞噬细胞、sIgA、Defensin等)。当机体受到严重感染、创伤、烧伤、放化疗和接受长期传统的肠外营养时，肠黏膜有可能通透性增高，损害肠屏障功能，导致细菌和内毒素移位，激发炎症细胞级联反应而释放多种细胞因子，并可导致活性氧自由基基团产生，引起全身炎性反应综合征(SIRS)，进一步可能发展成多器官功能障碍综合征(MODS)，故认为肠道既是MODS发生时受损的靶器官之一，又在MODS发生中起着始动器的作用，而肠黏膜屏障损害是其发生的关键。目前对此尚缺乏非常有效的治疗，如何早期诊断和遏制其病理生理进程显得尤为重要。内毒素是革兰氏阴性(G~-)菌细胞壁的脂多糖(LPS)成分，类脂A是LPS的“毒力中心”，属外源性介质。内毒素血症时补体系统被过量激活，刺激巨噬细胞、中性粒细胞释放大量炎症介质如肿瘤坏死因子(TNF-α)，白介素(IL-1、6、8)，血小板活化因子(PAF)等，可导致血管内皮损害，血小板和白细胞凝集，还可产生细胞毒性，损伤线粒体功能，最终导致全身炎症反应综合征(SIRS)。防御素(defensins)是一类阳离子多肽物质，具有空间结构分离的疏水和带电区域，这一结构特点允许它们将自身插入微生物富含带负电离子的磷脂膜中，破坏微生物胞膜的结构和功能，进而杀灭微生物。研究表明，防御素具有广谱抗菌活性，能杀灭细菌、真菌甚至一些封套病毒，而且还是先天性防御和获得性防御之间的重要信号物质。人类和大鼠等的肠道潘氏细胞(Paneth cell)产生的防御素为α-防御素，其中防御素-5(Defensin-5)活性最强，在肠道天然防御中的作用最为突出。潘氏细胞表达人类Defensin-5的转基因小鼠增强了对口服的致命性沙门氏菌的抵抗能力。出血性休克大鼠肠道屏障功能受损，潘氏细胞的Defensin-5 mRNA表达保护性增加。体外研究表明，来源于肠道黏膜的天然免疫物质重组人防御素-5(rHD-5)具有抑菌和抗黏附的双重作用，在防治肠源性感染中具有潜在的临床应用价值。双歧杆菌是肠黏膜屏障中生物屏障的主要成分，是人体主要的益生菌之一，参与了宿主的消化、营养、代谢、吸收、免疫及抗感染过程，尤其在维持机体肠黏膜屏障的完整性方面起重要作用。双歧杆菌作为肠黏膜的主要生物屏障，能够通过免疫排斥、免疫清除和免疫调节加强胃肠防御的各个防线，发挥抗感染、抗炎症和抗肿瘤的作用。目前对其抗菌机制的研究主要为以下三个方面：①产生有机酸，能显著降低环境中的pH值，使不耐酸的腐败菌和致病菌的生长繁殖受到抑制；②产生类似细菌素的蛋白质，有一定的杀菌作用；③产生过氧化氢(H_2O_2)，从而激活机体产生过氧化氢酶，抑制和杀灭革兰阴性菌。肠道菌群生态平衡对维持肠黏膜屏障的完整性有重要意义。外源性双歧杆菌在肠道定植，能拮抗潜在致病菌的过度增殖，减少细菌和内毒素移位，并能利用肠道谷氨酸合成谷氨酰胺，有利于肠损伤的恢复。双歧杆菌可刺激人肠腺上皮细胞β-防御素-2基因的表达，双歧杆菌分泌型黏附素能抑制LPS和H_2O_2对肠上皮的损害作用，从而保持肠黏膜屏障功能的完整性。上述研究从多种角度阐述了胃肠功能障碍对机体的危害和机体自身的保护性反应以及双歧杆菌对机体的保护作用，但是对幼年动物内毒素损伤时肠道的氧化损伤，细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和髓过氧化物酶(MPO)介导的炎症反应以及Defensin-5和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对肠损伤的保护作用目前尚未见国内外文献报道；双歧杆菌的肠道保护机制尚有待于更深入的研究。为此，本研究以腹腔注射内毒素(LPS)致幼鼠肠损伤为研究对象，应用分子生物学、组织化学及病理形态学的研究方法动态观察幼鼠肠损伤的形态学演变过程，研究幼鼠血清和回肠组织的氧自由基损伤、炎症介质损伤以及肠道的非特异免疫和IGF-1的保护机制，同时探讨外源性双歧杆菌对回肠组织的保护机制，为临床上预防胃肠功能障碍患儿发展为MODS/SIRS提供新的治疗手段和理论支持。材料和方法一、动物模型健康18日龄Wistar大鼠随机分为3组，对照组(C组)腹腔注射生理盐水(1ml/kg)，模型组(E组)腹腔注射内毒素(LPS，5mg/kg，用生理盐水配成5mg/ml)；治疗组(T组)注射LPS前1周给予双歧杆菌混悬液(2.0×10~9CFU/ml)灌胃，每次0.5ml，每日2次，直至实验结束。要补充实验过程中死亡动物，以达到所设定的标本数(每组每个时间点8只)。二、实验标本采集及处理分别于腹腔注射内毒素或生理盐水后2、6、12、24和72h断头处死动物，按以下方法留取和保存血清和回肠组织。 1、断头取血，离心(3500 r/min)15min，取血清-20℃保存，用于组织化学测定。 2、冰生理盐水冲洗肠腔内容物后，留取距回盲部2-3cm处回肠0.5-1cm，置于0.1mol/L PBS配置的4％多聚甲醛溶液中固定，用于H-E染色后观察组织病理学改变和免疫组织化学研究。 3、留取距回盲部3.4cm处回肠2.3cm，置于去RNA酶的Eppendorf管中，放入液氮后转移至-80℃冰箱中，用于提取总RNA后进行RT-PCR研究。 4、余下近回盲部回肠用滤纸吸干水分后，称重，用生理盐水或匀浆介质制成5％组织匀浆，离心(3000r/min)10min，留上清-20℃保存，用于组织化学测定。三、实验方法及检测指标 (一)回肠形态学研究 1、大体观察观察腹腔注射LPS或生理盐水后各组动物的反应情况；各组动物于各时间点处死后，剖开腹腔，观察肠管颜色、有无水肿、出血及扩张。 2、光镜观察固定后的回肠组织常规脱水，石蜡包埋，做4-5μm连续切片，常规苏木精-伊红(H-E)染色，光镜下观察肠组织形态学改变。 (二)组织化学方法检测血清和回肠组织SOD、MDA和MPO含量。 (三)免疫组织化学方法检测回肠组织胰岛素样生长因子(IGF-1)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)蛋白质表达。 (四) RT-PCR法检测回肠防御素-5(Defensin-5)、IGF-1和ICAM-1 mRNA表达。四、统计学分析采用SPSS10.0统计软件，计量资料结果以均值±标准差((?)±SD)表示，组间比较采用t检验法，P＜0.05提示差异有显著性意义。结果一、各实验组幼鼠回肠组织病理形态学改变 (一)大体改变动物实验中可见注射LPS后幼鼠出现懒动、萎靡、食欲下降，1-2h出现腹胀、腹泻，6-12h时上述症状加重，同时出现呼吸急促，口唇青紫，少动，体毛凌乱、少光泽，严重者抽搐，四肢青紫，周身凉，甚至死亡。存活者24h时上述症状部分缓解，72h基本恢复正常；提前给予双歧杆菌菌悬液灌胃的幼鼠症状较模型组轻，且恢复快。动物处死后，剖开腹腔可见对照组幼鼠肠管有光泽，颜色正常(淡黄色)；LPS组可见胃潴留明显，肠壁及肠系膜充血，肠管扩张、水肿，肠腔渗出物增多，严重者见肠壁点、片状出血，以6h组表现明显；双歧杆菌组幼鼠肠管所见较LPS组减轻。 (二) H-E染色后光镜下变化对照组小肠绒毛完整；内毒素组腹腔注射LPS后2h无明显异常，6h可见小肠绒毛腺体脱落、缺失，纹状缘变薄或缺失，肠绒毛高矮不一，密度减低，固有层毛细血管充血，炎细胞浸润，12h部分肠绒毛上皮细胞开始修复，24h修复明显，72h基本正常；双歧杆菌组腹腔注射LPS后2h未见明显异常，6h时可见小肠绒毛损伤，但是部分绒毛上皮细胞有修复，部分肠管杯状细胞分泌亢进，12h修复明显，，24h基本修复或正常，72h修复完全或正常。二、各实验组幼鼠血清和回肠组织SOD、MDA及MPO含量的变化 (一)血清和回肠组织SOD活性变化 LPS组血清SOD活性在6h、12h和24h与对照组比较有显著降低(P＜0.05)，双歧杆菌组SOD活性在2h、6h、12h及24h与LPS组比较有显著升高(P＜0.05)。 LPS组回肠组织SOD活性在6h、12h和24h与对照组比较有显著降低(P＜0.05)，双歧杆菌组SOD活性在6h和12h与LPS组比较有显著升高(P＜0.05)。 (二)血清和回肠组织MDA含量变化 LPS组血清MDA含量在6h、12h和24h与对照组比较有显著增加(P＜0.05)，双歧杆菌组MDA含量在6h、12h及24h与LPS组比较有显著下降(P＜0.05)。 LPS组回肠组织MDA含量在6h、12h和24h与对照组比较有显著增加(P＜0.05)，双歧杆菌组MDA含量在12h和24h与LPS组比较有显著降低(P＜0.05)。 (三)血清和回肠组织MPO含量变化 LPS组血清MPO含量在6h、12h和24h与对照组比较有显著增加(P＜0.05)，双歧杆菌组MPO含量在6h和12h与LPS组比较有显著降低(P＜0.05) LPS组回肠组织MPO含量在2h、6h和12h与对照组比较有显著增加(P＜0.05)，双歧杆菌组MPO含量在6h和12h与LPS组比较有显著下降(P＜0.05) 三、各实验组幼鼠回肠组织Defensin-5、IGF-1和ICAM-1的分子生物学变化 (一)回肠组织Defensin-5 mRNA的表达对照组回肠有少量Defensin-5 mRNA的表达，而模型组在LPS注射后2h表达明显增加，6h达高峰，以后各时间点的表达逐渐下降，在2h、6h及12h与对照组有显著性差异(P＜0.05)；双歧杆菌组Defensin-5的表达在LPS注射后2h较模型组下降，6h、12h及24h下降明显(P＜0.05)。双歧杆菌组与对照组比较，在2h和6h均比对照组增加，其中在2h差异明显(P＜0.05)，以后逐渐下降至正常。 (二)回肠组织IGF-1蛋白和mRNA表达 1、回肠组织IGF-1蛋白表达对照组各个时间点均有一定的IGF-1表达，表现为肠黏膜隐窝及上皮细胞较多量棕褐色颗粒；内毒素组IGF-1表达较对照组在各个时间点均减少，以12、24和72h为著(P＜0.05)，双歧杆菌治疗组IGF-1表达在6h开始较内毒素组增加，以12、24和72h为著(P＜0.05)，双歧杆菌组在6、12和24h表达较对照组增多，但无统计学上意义。 2、回肠组织IGF-1 mRNA的表达对照组各时间点回肠有较多量的IGF-1 mRNA表达；内毒素组回肠IGF-1mRNA表达较对照组减少，以6、12、24和72h为著(P＜0.05)；双歧杆菌治疗组回肠IGF-1mRNA表达从6h以后较内毒素组增加明显(P＜0.05)，其中12和24h较对照组增加，但没有统计学上意义。 (三)回肠组织ICAM-1蛋白和mRNA表达 1、回肠组织ICAM-1蛋白表达回肠ICAM-1的免疫组织化学染色结果显示：对照组小肠黏膜间质可见少量棕黄色颗粒，模型组小肠黏膜间质均有棕黄色颗粒，以6h为著，免疫组织化学平均光密度值在6h、12h、24h和72h均较对照组有显著性差异(P＜0.01)，双歧杆菌组小肠黏膜间质棕黄色颗粒与模型组比较先增加而后逐渐减少，在6h和12h光密度值较模型组增加(P＜0.01)，以后逐渐下降，在72h低于模型组(P＜0.01)，而与对照组则无显著性差异。 2、回肠组织ICAM-1 mRNA的表达对照组回肠有少量ICAM-1 mRNA的表达，而模型组在LPS作用2h后表达明显增加(P＜0.01)，以后各时间点与对照组无显著性差异；双歧杆菌组在注射LPS 2h较模型组表达下降(P＜0.01)而与对照组无显著性差异，在6h和12h表达较模型组明显增加(P＜0.01)，24h下降明显，与对照组和模型组比较均有显著性差异(P＜0.01)，72h回升至正常。结论 1．、双歧杆菌能减轻内毒素损伤幼鼠的回肠组织病理学改变，并能促进组织损伤的修复。 2、内毒素损伤幼鼠血清和回肠组织SOD活性降低、MDA含量增加，双歧杆菌能增加SOD活性，同时降低MDA含量，表明双歧杆菌能通过抑制脂质过氧化损伤而对幼鼠有一定的保护作用。 3、内毒素损伤幼鼠血清和回肠MPO含量增加，同时回肠组织ICAM-1蛋白质和mRNA表达增加，外源性给予双歧杆菌能降低内毒素组MPO和ICAM-1的增加，表明双歧杆菌能通过抑制大鼠体内的MPO含量和ICAM-1的表达而保护肠道。 4、内毒素损伤幼鼠回肠组织IGF-1表达降低，外源性双歧杆菌能抑制IGF-1的表达降低，双歧杆菌可能通过抑制局部炎症反应从而提高IGF-1表达而保护肠道。 5、内毒素损伤幼鼠回肠组织Defensin-5 mRNA表达增加，给予外源性双歧杆菌后Defensin-5 mRNA的表达没有继续增加，反而表达下降，而肠道的炎性损伤却在逐渐缓解，表明双歧杆菌能保护肠道，但不是通过增加肠道Defensin-5的分泌的途径。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R371;R725.7

【相似文献】