IL-1ra突变体的研究
本文关键词：IL-1ra突变体的研究 出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2005年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra)为IL-1家族中的一员,其本身无任何激动剂的作用,但能特异性地与IL-1受体结合,从而拮抗IL-1的各种生物学效应。2001年,由Amgen公司生产的重组人白细胞介素1受体拮抗剂(rhIL-1ra,专利名称为Kineret)被美国食品与药物管理局(FDA)和欧洲EMEA批准上市,用于类风湿性关节炎的治疗,但是由于微量的IL-1就可以引起完全的生物学效应,在疾病治疗过程中只有IL-1ra与IL-1的比值达到10000-100000时才能有效地缓解症状,因此rhIL-1ra的用量高达100-150mg/d,频繁用药加重了病人的身体、心理和经济负担。 本研究旨在利用定点突变,延长IL-1ra的半衰期,提高其代谢稳定性。 本课题首先利用重叠延伸PCR对IL-1ra的基因进行以下几个位点的突变:R~6K~7-AA,R~(93)K~(94)-AA,K~(97)R~(98)-AA。将IL-1ra及三个突变体的序列插入表达载体pTIG-Trx,利用大肠杆菌BL21(DE3)对其进行表达,表达产物先后经镍柱亲和纯化,SephadexG75凝胶过滤获得纯度在90%以上的目的蛋白。利用EL-4,CTLL-2细胞对目的蛋白进行体外活性检测,结果表明,与IL-1ra相比,三个突变体的生物学活性并未降低。利用大耳白兔对野生型IL-1ra及三个突变体进行了初步的药代动力学分析,其中3号突变体的半衰期与野生型IL-1ra相比提高了2.26倍。 本课题为提高IL-1ra的代谢稳定性的研究奠定了初步的基础。
[Abstract]:Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1raa) is a member of the IL-1 family. It has no agonist effect on itself, but it can specifically bind to IL-1 receptor. In 2001, rhIL-1ra, a recombinant human interleukin-1 receptor antagonist, was produced by Amgen Company. The patent name Kinereta is approved by the Food and Drug Administration (FDA) and the European EMEA for the treatment of rheumatoid arthritis. However, a small amount of IL-1 can cause a complete biological effect. Only when the ratio of IL-1ra to IL-1 reaches 10000-100000 can the symptoms be effectively alleviated during the course of treatment. As a result, the use of rhIL-1ra is as high as 100-150 mg / d, increasing the physical, psychological and economic burden of patients. The aim of this study was to prolong the half-life and improve the metabolic stability of IL-1ra by site-directed mutation. In this study, overlap extension PCR was first used to mutate the IL-1ra gene in the following several loci. The sequences of IL-1ra and three mutants were inserted into the expression vector pTIG-Trx and expressed by E. coli BL21 (DE3). The expressed product was purified by nickel column affinity chromatography and purified by Sephadex G75 gel filtration. The target protein with purity above 90% was obtained by EL-4. The activity of the target protein was detected by CTLL-2 cells in vitro. The results showed that the activity of the target protein was higher than that of IL-1ra. The biological activity of the three mutants was not decreased. The pharmacokinetic analysis of wild type IL-1ra and three mutants was carried out by using large ear white rabbits. The half life of mutant 3 was 2.26 times higher than that of wild type IL-1ra. This paper lays a foundation for improving the metabolic stability of IL-1ra.
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R392
【共引文献】
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，本文编号：1373231
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