结核分枝杆菌38kD蛋白表达载体的构建和重组38kD蛋白纯化及鉴定

发布时间：2018-01-05 17:31

  本文关键词：结核分枝杆菌38kD蛋白表达载体的构建和重组38kD蛋白纯化及鉴定　出处：《华南热带农业大学》2006年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 据世界卫生组织统计,全世界现有结核病人3000万,每年新发生约900万例,每年死亡300万人。目前结核病还没有很理想的诊断技术。结核病的诊断尤其是早期的诊断对结核病的防治有着非常关键的作用。结核菌38kD蛋白具有强免疫性,特异性高于混合蛋白制成的抗体检测试剂,能将结核病患者与BCG接种阳转健康者区分开来。38kD蛋白在结核病血清学诊断上有很好的应用前景。 本实验研究目的,是通过结核分枝杆菌38kD蛋白基因克隆及大肠杆菌表达载体的构建,以转基因技术导入大肠杆菌,诱导表达,纯化,并鉴定该蛋白,以获得大量38kD抗原。 根据结核菌编码38kD蛋白的基因系列,设计一对特异引物,通过PCR技术从结核菌H37Rv基因组DNA扩增出38kD蛋白基因片段,成功连接到克隆载体pMD 18-T Simple Vector。测序鉴定为正确的38kD蛋白基因;目的片段克隆到原核表达载体pET-30a中,成功构建成带有C端6His-tag的融合表达载体。利用化学转化法将重组表达载体转化E. coli BL21(DE3),PCR检测获得阳性的工程菌株;经IPTG诱导和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,本试验成功获得了能够表达的工程菌株。摇瓶培养确定工程菌摇瓶发酵最适温度为37℃,发酵时间最短时间为0.5h,此时可达到最大表达量。诱导剂IPTG最小使用浓度为0.5 mmol/L。表达方式分析发现该重组蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在。并对包涵体进行纯化纯度达到90%。利用镍琼脂糖凝胶FF亲和柱层析对重组蛋白进行了初步的纯化研究。SDS-PAGE和免疫印迹法( Western blotting )检测表明我们获得纯化的重组38kD蛋白。酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印迹实验结果说明重组38kD蛋白可被结核病病人血清识别,进一步鉴定重组蛋白就是结核菌38kD蛋白,也说明了重组38kD蛋白具有良好的免疫反应性,可用于结核病的免疫学诊断。 本研究获得了能够表达结核菌38kD蛋白的重组工程菌株,摸索出蛋白表达的合适条件,初步证实重组38kD蛋白具有良好的免疫反应性,为结核病的免疫学诊断打下了基础。
[Abstract]:TB 38 kD protein has strong immunity and specificity higher than that of mixed protein . The 38 kD protein has good application prospect in the diagnosis of tuberculosis serologic . The purpose of this experiment was to clone the 38kD protein gene of Mycobacterium tuberculosis and construct the expression vector of E . coli , introduce the gene into E . coli , induce expression , purify , and identify the protein to obtain a large amount of 38 kD antigen . coli BL21 ( DE3 ) was cloned into prokaryotic expression vector pET - 30a . The recombinant protein was cloned into prokaryotic expression vector pET - 30a . The recombinant protein was cloned into E . coli BL21 ( DE3 ) . This study has obtained the recombinant engineering strain capable of expressing the 38kD protein of mycobacterium tuberculosis , and finds out the suitable conditions for the expression of the protein , and preliminarily proves that the recombinant 38kD protein has good immunoreactivity and lays a foundation for the immunological diagnosis of tuberculosis .

【学位授予单位】：华南热带农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R346;Q78

【引证文献】

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1 王胜;Cry1Aa-CpTI融合蛋白的原核表达及其对斜纹夜蛾杀虫活性研究[D];海南大学;2010年

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本文编号：1384137