甲胎蛋白对树突状细胞功能及其凋亡的影响

发布时间：2018-01-10 00:22

  本文关键词：甲胎蛋白对树突状细胞功能及其凋亡的影响　出处：《吉林大学》2007年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： DCs是目前公认的体内功能最强大的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell,APC),它能激活静息型T细胞,在抗原的加工、处理及传递过程中起重要的作用。尤其是其抗肿瘤功能,近年来受到越来越多的重视。AFP作为一种胚胎性肿瘤相关蛋白,可以在大80%的原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者血清中升高,在临床上主要用于HCC的诊断、高危人群的普查及HCC手术或其他方法的疗效评定。但是,随着研究的深入人们发现AFP具有免疫抑制作用,它能有效抑制母体对胎儿的排斥,能抑制原发性肝癌病人免疫系统功能,促进淋巴细胞凋亡从而逃避机体的免疫监视。然而,AFP是一种生物学活性非常复杂的蛋白质,其免疫抑制作用目前并未完全清楚。 为此,我们在成功制备人外周血来源DCs基础上,在体外以不同浓度AFP处理DCs,着重探讨AFP对DCs分化、成熟及其生物学功能的影响,以及AFP对DCs凋亡的影响及其机制。本研究从以下三个方面进行: 1、人外周血来源DCs的体外扩增及鉴定 人外周血单个核细胞为DCs前体细胞诱导成熟DCs,利用细胞的粘附附特性,对经淋巴细胞分离液初步纯化细胞进行分离,有效地将DCs前体细胞(主要为单核细胞)与非黏附细胞(主要为混和淋巴细胞)分离。诱导5天后,再次利用细胞的黏附特性,收集非贴壁DCs于新的培养板中培养,可去除其它细胞(如巨噬细胞等)对DCs生长的影响。外周血单个核细胞在联合细胞因子GM-CSF、IL-4及TNF-α作用下逐渐表现典型DCs形态。培养第9天的细胞显示,该类细胞高表达表面分子HLA-DR,CDla,CD11c,共刺激分子CD80、CD86,成熟DCs特异性标志CD83。并具有很强的刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。从细胞表型,细胞形态学及混合淋巴细胞反应分析证实,从外周血单个核细胞中诱导分化的细胞为DCs。 2、AFP对DCs表型及功能的影响 为探讨AFP对DCs增殖的影响,我们用不同浓度AFP(1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml)处理培养第5天DCs细胞,孵育72 h。MTT法检测DCs增殖情况。结果表明,AFP对DCs细胞的生长有一定的抑制作用,AFP浓度在1μg/ml到40μg/ml之间,随着AFP浓度的增加,抑制作用逐渐加强。 为检测AFP对DCs表型影响,用浓度为20μg/ml AFP处理培养第7天DCs细胞,培养24小时,加入6种抗体(Anti-HLA-DR,Anti-CD1a、Anti-抗CD83、Anti-CD80、Anti-CD86、Anti-CD11c),通过流式细胞仪检测荧光并记录结果。结果表明,AFP处理DCs的HLA-DR、CD1a、CD11c、CD80、CD83、CD86分子表达均明显低于对照组,差异具有显著性(P0.05) 为研究AFP对DCs刺激淋巴细胞增殖能力的影响进行混合淋巴细胞反应。用不同浓度AFP处理DCs作为刺激细胞,异体淋巴细胞作为反应细胞, MTT法于波长570 nm处检测OD值。结果显示,成熟DCs对淋巴细胞具有很强的刺激增殖作用,而未成熟DCs刺激淋巴细胞增殖能力相对较弱。各浓度的AFP对抑制刺激T淋巴细胞增殖的能力明显低于对照组,且AFP浓度越高,DCs刺激淋细胞增殖能力越低。 3.AFP诱导DCs凋亡的体外研究 为研究AFP对DCs凋亡的影响,将DCs分为DCs+AFP、DCs+HSA、DCs+AFP+Anti-AFP、DCs+AFP+SB203580、DCs+AFP+DEVD-fmk5组,别分别加入AFP、HSA、AFP抗体、p38-MAPK通路阻断剂SB203580、Caspase抑制剂DEVD-fmk,以未处理DCs为对照。培养24 h加入Annexin V-FITC及PI,流式细胞仪检测DCs凋亡。结果显示不同浓度的AFP均能促进DCs凋亡,且随着浓度的增加,DCs凋亡指数增加。加入SB203580及DEVD-fmk后凋亡指数下降,HSA及AFP+Anti-AFP未影响DCs凋亡。 为进一步研究AFP诱导DCs凋亡的机制,我们用JC-1染色法检测各组DCs线粒体膜电势的变化,用Western法检测各组DCs活性Caspase-3及磷酸化p38MAPK的表达情况。结果显示在AFP(20μg/ml)诱导DCs凋亡的过程中伴随着线粒体膜电势的下降、活性Caspase-3及磷酸化p38MAPK的表达。与HSA组及AFP抗原抗体复合物组相对照说明是AFP导致线粒体膜电势的下降,诱导caspase-3及p38MAPK的表达。其中,Caspase抑制剂DEVD—fmk能阻断AFP诱导的DCs凋亡,使活性Caspase-3表达下降,但未影响线粒体膜电势的下降及p38MAPK的高表达。p38MAPK抑制剂SB203580能够明显减少AFP诱导的DCs凋亡,部分阻止线粒体膜电势的下降,抑制活性Caspase-3及磷酸化p38MAPK的表达。 综上所述:(1)AFP下调DCs表面分子的表达,抑制其刺激淋巴细胞增殖能力;(2)AFP可能通过线粒体途径促进DCs的凋亡;(3)p38MAPK信号转导通路可能参与AFP介导的DCs凋亡;(4)AFP可能通过“AFP—p38MAPK—线粒体—Caspase”信号转导模式诱导DCs凋亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】

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本文编号：1403124