河北省不同地区粮食赭曲霉毒素A污染情况及OA致细胞损伤作用的研究

发布时间：2018-01-13 01:15

本文关键词：河北省不同地区粮食赭曲霉毒素A污染情况及OA致细胞损伤作用的研究　出处：《河北医科大学》2007年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 赭曲霉毒素(Ochratoxins,OT)是由赭曲菌(Asperegillus alutacells)和纯绿青霉(Penicillium viridicatum)产生的有毒代谢产物,包括七种结构类似的化合物,其中以赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OA)为主,毒性也最大。OA的分子量为404,熔点169℃,为无色晶体,易溶于有机溶剂(三氯甲烷和甲醇)和稀碳酸氢钠溶液,微溶于水。在紫外线照射下OA呈绿色荧光,最大吸收峰为333nm。该化合物相当稳定,一般的烹调和加工方法只有部分破坏。动物实验表明,赭曲霉毒素A具有肾毒性、免疫毒性和致癌、致畸、致突变性。1993年国际癌症研究中心将赭曲霉毒素A列为可能的人类致癌物。一些国家已报道了从人全血、血清及人奶中检出赭曲霉毒素A。研究表明,粮食污染是人类赭曲霉毒素A暴露的主要途径。研究分析粮食赭曲霉毒素A污染情况对保障食品卫生和安全具有非常重要的意义。目前,国外文献中已有不少粮食赭曲霉毒素A污染情况的分析检测报道,不少国家和国际组织还根据赭曲霉毒素A的污染情况制定了人体赭曲霉毒素A摄入量的限制标准。迄今为止,国内有关粮食中赭曲霉毒素A的污染情况报道较少。目前,有关粮谷中赭曲霉毒素A的检测方法主要有薄层色谱法(TCL)、酶免疫检测法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)等。我国谷物和大豆中赭曲霉毒素A的国家标准检测方法是TCL法,属于目测半定量法,最低检出量为10μg/kg,不适用于粮谷中赭曲霉毒素A的准确测定和居民赭曲霉毒素A的膳食摄入量的暴露评估研究。为准确分析我国粮食中OA的污染情况,进一步探讨OA污染的生物学意义,本研究对OA的检测方法进行了改进,建立了灵敏度高、重现性好、准确可靠的OA高效液相色谱荧光定量检测方法。对河北省不同地理环境的三个地区粮食中赭曲霉毒素A污染情况进行了定量检测。同时,以细胞培养、FCM等方法研究了OA对人外周血单个核细胞增殖和凋亡的影响,探讨了OA对人正常肾小管上皮细胞株(HKC)和人肺泡II型上皮细胞(AT-II)细胞系A549凋亡的诱导作用。在上述工作的基础上,采用Western Blotting和免疫组化方法等方法在蛋白水平上对JNK通路在OA诱导细胞损伤中作用及OA诱导细胞损伤的机制进行了研究。本研究共分为五部分: 第一部分:赭曲霉毒素A检测方法的建立目的:建立SPE - C_(18)柱纯化和富集—高效液相色谱法荧光检测粮谷和酒类样品中赭曲霉毒素A的系列方法。方法:1用三氯甲烷提取玉米、小麦和大麦样品中的OA后,经C_(18)固相萃取柱净化处理,以乙腈:水:乙酸(99:99:2)作为流动相,用带有荧光检测器的反相高效液相色谱法(激发波长为333nm,发射波长为460nm)检测OA含量;2选用C_(18)固相萃取小柱(250mg/3ml),用2ml乙腈和2ml水分别活化C_(18)小柱,30ml酒样通过C_(18)固相萃取小柱,控制流速30滴/分。再用2ml乙腈溶液洗脱,最后将C_(18)小柱抽干。45℃下氮气吹干,流动相溶液稀释至0.5ml,0.45μm微孔滤膜过滤后取20μL进高效液相色谱仪进行检测。结果:1.分别在小麦和大麦样品中加入3种不同量的OA标准物。小麦加标样品的回收率为78.60%~92.73%,变异系数为1.46%~2.98%,大麦加标样品的回收率为77.61%~93.21%,变异系数为1.74%~3.45%;为考察该方法的准确度,对北京中检维康玉米加标盲样(OA浓度范围介于5.33~9.91ng/g)进行了检测,结果为6.75ng/g,在盲样范围内,经t检验,在95%的置信水平上,测定平均值(n=3)与盲样给定值无显著性差异。2.本实验对干红葡萄酒,白葡萄酒和红葡萄酒分别进行了0.25ng/ml、0.5ng/ml、1.5ng/ml三个浓度的加标回收,对三种葡萄酒样品,每个加标水平平行3份,按上述方法提取测定,各种样品的加标回收率均在80.1~109.8%。平行三次测定加标回收率的相对标准偏差在1.5~5.2%之间。第二部分:河北省不同地区粮食中赭曲霉毒素A污染情况研究目的:分析河北省不同地理环境地区居民食用粮食OA污染情况,了解河北省居民OA的暴露量,揭示其对健康的可能影响,为减少OA污染及其影响奠定基础。方法:抽样检测河北省不同地理环境的三个代表性地区粮食OA污染情况,三个地区分别为河北省南部邯郸市磁县、河北省中部石家庄市赞皇县和河北省北部塞外地区张家口市赤城县。分别入户采取中南部地区居民日常食用主粮小麦和北部地区居民日常食用主粮大麦样品。采用反相—高效液相色谱法检测OA含量:用三氯甲烷提取小麦和大麦样品中的OA后,经C18固相萃取柱净化处理,以乙腈:水:乙酸(99:99:2)作为流动相,用带有荧光检测器的高效液相色谱仪(激发波长为333nm,发射波长为460nm)检测OA含量。结果:大麦样品OA经反相—高效液相色谱法检测结果表明,张家口市赤城县31份大麦样品中,11份样品检测到OA,污染率为35.48%,其平均含量为6.96μg/kg,最低者为0.21μg /kg,而最高可达35.36μg/kg;赞皇县居民食用小麦样品中赭曲霉毒素A的检出率为45.16%,平均含量2.41μg/kg,最高达14.25μg/kg。河北省磁县居民食用小麦中赭曲霉毒素A的检出率为33.33%,平均含量0.59μg/kg,最高为1.63μg/kg。根据居民人均食用粮食重量计算,赞皇县农村居民OA的日暴露量为1.17μg/ kg,磁县农村居民OA的日暴露量为0.31μg/kg,张家口赤城农村居民OA的日暴露量为3.38μg/kg,超过世界卫生组织/粮农组织联合专家委员会暂定的容许摄入量。可见河北省不同地理环境居民食用粮食中OA的污染均比较普遍,应当引起有关部门的重视。第三部分赭曲霉毒素A对体外培养HPBMCs增殖与凋亡的研究目的:探讨OA对体外培养HPBMCs增殖与凋亡的影响,揭示OA暴露对机体免疫功能的可能作用。方法:健康献血员抗凝静脉血200mL,采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法(ficoll-hypaque density gradient centrifug- ation)分离人外周静脉血单个核细胞,接种于含10%胎牛血清,105U/L青霉素,100mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中,加入PHA并使其终浓度为300μg/mL,37℃、5%CO_2培养24h,更换不含PHA的新的培养液。HPBMCs随机分为4组:空白对照组、溶剂对照组、1μmol/L OA和5μmol/L OA实验组。实验组分别给予乙醇溶解的OA处理,使其终浓度分别为1μmol/L和5μmol/L,对照组和溶剂对照组分别给予等体积生理盐水和乙醇处理。细胞继续培养24h,常规收集细胞,采用流式细胞定量检测术(FCM)检测HPBMCs细胞凋亡率和增殖指数,以及细胞凋亡相关蛋白Caspase-3的表达。结果: FCM检测结果表明, OA处理24h,1μmol/L OA和5μmol/L OA组HPBMCs细胞凋亡率分别为10.90±0.85%,16.03±0.37%,均高于对照组(8.17±1.45%,P0.05)。1μmol/L OA和5μmol/L OA组细胞增殖指数分别为35.77±4.74和36.89±7.63,与对照组比较差异无显著性(33.53±1.97,P0.05),说明OA处理24h可以促进HPBMCs凋亡,但对细胞增殖没有影响。 FCM定量分析表明,OA作用24h后,1μmol/L OA和5μmol/L OA组HPBMCs细胞Caspase-3蛋白表达FI值明显高于对照组(1.13±0.02和1.14±0.06 vs 1.00±0.04,P 0.05)。第四部分:赭曲霉毒素A对A-549和HKC细胞损伤的研究目的:探讨OA处理对A549和HKC细胞增殖与凋亡的影响及可能机制,并观察OA对体外分离的DNA致损伤作用。方法:取对数生长期A549和HKC细胞,用10%DMEM调整细胞浓度为(1~2)×10~8L~(-1),接种于细胞培养板和细胞培养瓶中。细胞培养24h后,随机分为4组:空白对照组、溶剂对照组、1μmol/L OA和5μmol/L OA实验组。实验组分别给予OA 1μmol/L和5μmol/L处理,溶剂对照组和对照组分别给予DMSO(0.4mL·L~(-1))和生理盐水处理,继续细胞培养24h。采用MTT法检测A549和HKC细胞存活率。采用FCM检测A549和HKC细胞凋亡率,以及细胞凋亡相关蛋白Caspase-3的表达表达情况;采用紫外以及荧光光谱法检测了OA与小牛胸腺和鲑鱼精DNA的相互作用形成的DNA加合物。结果:MTT检测结果表明,OA对A549和HKC细胞的生长均有一定抑制作用:1μM、5μM OA作用不同时间后,两株细胞存活率均较相应对照组降低,尤以24h更明显(P0.05)。1μM、5μM OA处理24h后,A549细胞存活率分别为80.71%和70.85%,明显低于对照组(100%,P0.05);HKC细胞存活率分别为51.09%和54.69%,也低于对照组(100%,P0.05)。提示OA对A549和HKC细胞具有明显的致损伤作用。 FCM检测细胞凋亡率检测结果表明,A549细胞经1μM、5μM OA处理24h后,OA处理细胞凋亡率明显升高,5μM OA处理组凋亡率为2.68±0.55%,明显高于对照组(1.53±0.23%,P0.05)。HKC细胞经OA处理24h后,1μM和5μM OA组细胞凋亡率分别为3.85±0.29%和4.86±0.51%,均明显高于对照组(1.23±0.05%,P0.05)。表明OA对A549和HKC细胞具有明显的促凋亡作用。 FCM检测组方图及定量分析表明,OA作用24h后,A549和HKC细胞Caspase-3蛋白表达量均明显高于对照组。紫外光谱法分析结果显示DNA与OA没有发生相互作用;荧光光谱法分析结果显示OA没有与DNA相结合。第五部分:JNK信号转导通路在赭曲霉毒素A诱导HKC凋亡中的作用目的:探讨JNK信号转导通路在赭曲霉毒素A诱导HKC凋亡中的作用,以期进一步探讨OA诱导凋亡的可能机制。方法: 5.1 OA对HKC细胞JNK激酶活性和Caspase-3蛋白表达影响的检测实验分组与处理同论文第四部分有关OA作用HKC细胞24h的实验分组和处理。细胞处理24h后,离心收细胞用于相关指标的检测。采用免疫细胞化学方法和Western blot方法检测HKC细胞p-JNK水平,JNK和Caspase-3蛋白表达。 5.2 JNK抑制剂SP600125预处理对OA诱导HKC细胞JNK激酶活性、凋亡率、Caspase-3蛋白表达和细胞损伤影响的检测选择对数生长期的细胞(传代24h后),随机分为空白对照组、溶剂对照组、OA处理组和JNK阻断剂组。1μM OA处理组给予终浓度为1μM OA;JNK阻断剂组预先加入0.5μM SP600125孵育30min后再加入1μM OA ;空白对照组加入生理盐水;溶剂对照组加入乙醇(1:500)+DMSO(1:30000)。细胞培养24h后消化离心收集细胞。采用Western blot方法检测HKC细胞p-JNK水平;采用流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率和Caspase-3蛋白表达;采用MTT比色法检测HKC细胞的存活率。结果 5.1OA对HKC细胞Caspase-3蛋白表达的影响免疫细胞化学染色,光镜下观察可见Caspase-3蛋白免疫阳性反应产物为棕黄色颗粒状,定位于HKC细胞胞浆内。1μMOA、5μM OA处理组HKC细胞Caspase-3阳性表达细胞比率分别为54.03±9.21%,60.75±9.95%,明显高于对照组(14.31±4.24%,P0.05)。 Western blot检测发现,给予不同剂量OA处理后,细胞Caspase-3蛋白表达明显高于对照组,进一步证实给予OA处理可以促进体外培养HKC细胞Caspase-3蛋白的表达。 5.2OA对HKC细胞p-JNK水平的影响免疫细胞化学染色可见p-JNK阳性染色为棕黄色颗粒,定位于HKC细胞胞浆及胞核内。1μMOA和5μMOA处理组HKC细胞阳性表达细胞比率分别为53.31±11.01%和58.53±11.11% ,明显高于对照组(10.19±6.85%,P0.05)。Western Blot检测发现,给予不同剂量OA处理后,HKC细胞p-JNK水平明显高于对照组(P0.05),实验结果表明,给予OA处理可以提高体外培养HKC细胞JNK磷酸化水平。 5.3OA对HKC细胞JNK蛋白表达的影响免疫细胞化学方法和Western blot结果显示OA对HKC细胞JNK蛋白表达没有影响。 5.4 SP600125预处理对OA作用后HKC细胞p-JNK激酶活性的影响免疫细胞化学染色可见,JNK阻断剂组HKC细胞p-JNK激酶阳性表达细胞比率为15.51±3.35%,明显低于1μM OA处理组(53.28±7.08%,P0.05,)。Western blot检测发现,给予SP600125预处理HKC细胞p-JNK水平明显降低。实验结果表明,给予SP600125预处理可以降低HKC细胞p-JNK的表达,进一步说明OA处理可以激活JNK信号转导通路。 5.5SP600125预处理对OA作用后HKC细胞凋亡率的影响 FCM细胞凋亡率检测结果表明, HKC细胞经SP600125预处理30min后,JNK阻断剂组+OA组细胞凋亡率为2.44±0.38%,低于单纯OA处理组(4.24±0.38%, P0.05),但高于空白对照组的细胞凋亡率1.06±0.14%(P0.05)。实验结果表明,SP600125预处理可以部分抑制体外培养人肾小管上皮细胞HKC的凋亡。 5.6 SP600125预处理对OA作用后HKC细胞凋亡相关蛋白 Caspase-3蛋白表达的影响免疫细胞化学染色可见,JNK阻断剂组Caspase-3阳性表达细胞比率为31.42±4.67%,较1μMOA处理组明显降低(55.86±6.51%,P0.05),但高于对照组(13.97±1.59%,P0.05)。Western blot检测结果证实给予SP600125预处理可以部分降低OA引起的HKC细胞Caspase-3蛋白的表达。推测OA给予SP600125预处理可以部分降低OA引起的HKC细胞Caspase-3蛋白的表达。OA通过激活JNK信号转导通路部分介导caspase-3蛋白活化。 5.7SP600125预处理对OA作用后HKC细胞存活率的影响 MTT检测结果发现给予特异性JNK阻断剂-SP600125预处理后,JNK阻断剂+OA组HKC细胞的存活率为82.09%,明显高于单独OA处理组(66.83%,P0.05);但是低于溶剂对照组(98.58%,P0.05),说明SP600125对OA致HKC细胞损伤具有部分阻断作用,OA通过JNK信号转导通路参与介导细胞死亡。结论: 1.建立了反相—高效液相色谱法检测粮谷和酒类样品中赭曲霉毒素A的系列方法,本方法具有准确度高、精密度好和灵敏度高等优点。可定量检测粮谷和酒类样品中赭曲霉毒素A,检测结果准确可靠,提取净化过程简单等优点,为食品中赭曲霉毒素A污染情况调查和居民对赭曲霉毒素A的暴露评估提供了有力的技术支持和保障。 2.通过对河北省不同地区居民食用主粮调查发现:河北省中南部地区居民食用小麦中OA的检出率达39.34%,北部地区居民食用的大麦中OA的检出率达到35.48%,均明显高于国内已有的研究报道。赞皇县农村居民OA的日暴露量为1.17μg/ kg,磁县农村居民OA的日暴露量为0.31μg/ kg,张家口赤城农村居民OA的日暴露量为3.38μg/ kg,超过世界卫生组织/粮农组织联合专家委员会暂定的容许摄入量。可见河北省不同地理环境居民食用粮食中OA的污染均比较普遍,应当引起重视。 3. OA可以促进体外培养HPBMCs凋亡,上调Caspase-3蛋白表达,但对HPBMCs增殖没有明显影响。 4. OA可抑制体外培养A549和HKC细胞增殖,上调Caspase-3蛋白的表达,促进体外培养A549和HKC细胞凋亡。OA可能对体外分离的DNA没有损伤作用。 5. OA可以提高体外培养HKC细胞p-JNK水平,激活JNK途径。 6. JNK抑制剂SP600125预处理降低OA诱导的细胞凋亡、Caspase-3蛋白上调及细胞损伤作用,提示JNK信号转导通路部分参与OA介导细胞损伤和凋亡过程。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R363

【引证文献】