与雌激素受体相互作用蛋白FHL2的功能研究

发布时间：2018-01-13 02:38

本文关键词：与雌激素受体相互作用蛋白FHL2的功能研究　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2007年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 雌激素受体(estrogen receptor，ER)是核受体超级家族成员之一，它包括两种亚型：α和β。两种亚型在结构上基本相似，均分为4个功能结构域，即转录激活区AF1和AF2，DNA结合结构域(DBD)及位于D区的铰链区。AF1具有配体(雌激素)不依赖的转录激活功能，AF2具有配体依赖的转录激活功能。AF1和AF2的有效转录激活均依赖于与其它蛋白质的相互作用，ER通过AF1和AF2相互协同作用调控雌激素应答的基因表达。ER在乳腺癌的发生发展中起重要作用，乳腺癌内分泌的治疗主要是通过降低ER转录活性而实现。因此调节ER转录活性的蛋白因子的发现和相应的功能研究对于探讨乳腺癌的发病机制、预防乳腺癌的发生、有效开发治疗与雌激素相关疾病的药物具有重大意义。我们以ERβAF1(1-145aa)为诱饵，用酵母双杂交技术从人乳腺cDNA文库中分离到了未曾报道的与ERβ相互作用的蛋白质FHL2。FHL2是FHL家族蛋白成员，含4个半LIM结构域，LIM结构域的双锌指结构广泛地介导了蛋白—蛋白间的相互作用。为进一步确认FHL2与ER之间存在特异性的蛋白质间相互作用，我们进行了GST沉降和免疫共沉淀实验，结果表明，FHL2和ERa、ERβ在体外和体内都存在相互作用，获得了与酵母双杂交结果相一致的实验结果。通过FHL2和ER不同功能域缺失的系列突变体，揭示了FHL2和ER发生相互作用的结合区域，FHL2 N端的半个LIM结构域就能与ER结合，FHL2与ERβ的AF1区结合，与ERa的AF2区结合。FHL2同一家族的另外2个成员FHL1、FHL3也能与ER相互作用。在转染含雌激素应答元件的ERE荧光素酶报告基因实验中，FHL2能以剂量依赖的方式抑制ER介导的ERE荧光素酶报告基因的转录。通过活性实验，进一步发现FHL2抑制雌激素应答元件的报告基因转录活性的功能依赖于ER的存在，而且不是通过影响ER的表达水平而实现的。为了深入研究FHL2基因的功能，我们制备了抗FHL2的鼠多克隆抗体，并利用该抗体检测了FHL2在大鼠不同组织及其乳腺癌细胞株中的表达。随后我们构建了有效的FHL2 siRNA真核表达载体，将RNAi实验与活性实验相结合，发现抑制FHL2的表达后，FHL2抑制雌激素应答元件的报告基因转录活性的功能也受到抑制。同时在乳腺癌细胞株T47D中构建了FHL2过表达和低表达的稳定转染细胞株，，再次从正反两方面验证了FHL2能抑制ER报告基因的转录，由此推测FHL2是ER的共抑制子。本实验室已证明FHL2与Smad4也存在相互作用，另有文献表明Smad4能抑制ER下游基因的转录活性。我们利用转录活性实验证明FHL2与Smad4能协同促进ERβ调节报告基因的转录；同时免疫共沉淀实验也表明FHL2、Smad4与ERβ共存在于同一复合物中。这些研究结果表明，FHL2可能是雌激素信号通路的一个新型调控因子，通过与ER相互作用参与信号通路的调控，进一步的深入研究将有助于了解新型雌激素受体ERβ信号通路的调控机制，为阐明乳腺癌的发生机制开辟一个新的思路。
[Abstract]:The estrogen receptor ( ER ) is one of the members of the nuclear receptor super family . It includes two subtypes : 伪 and 尾 . The two isoforms are structurally similar and are divided into four functional domains , namely , transcriptional activation regions AF1 and AF2 , DNA binding domain ( dbd ) and hinge region located in the D region . The active transcription activation of AF1 and AF2 is dependent on the interaction with other proteins . We used ER尾 AF1 ( 1 - 145 aa ) as bait , and isolated from human breast cDNA library by yeast two - hybrid technique , which was a member of FHL family protein , containing 4 semi - LIM domains and LIM domain . The structure of double zinc fingers mediated the interaction of protein - protein . In order to further confirm the specific protein - to - protein interactions between HLA - L2 and ER , we carried out GST - sedimentation and immune co - precipitation experiments . The results showed that the binding region of the interaction between the two hybrid results was obtained . In the experiment of transfected ERE luciferase reporter gene transfected with estrogen responsive element , the transcription of ER - mediated ERE luciferase reporter gene was inhibited in dose - dependent manner . In order to study the function of the gene , we prepared a polyclonal antibody to the mouse polyclonal antibody , and then used the antibody to detect the expression of the mRNA in different tissues and breast cancer cell lines of the rat . After that , we constructed an effective eukaryotic expression vector of the siRNA , which was used to inhibit the transcriptional activity of the reporter gene of the estrogen responsive element . We have shown that Smad4 can inhibit the transcription activity of ER downstream genes . We prove that Smad4 can promote the transcription of ER 尾 - regulated reporter gene by means of transcriptional activity . At the same time , the co - precipitation experiment also shows that the coexistence of Smad4 and ER尾 is in the same complex . The results of these studies indicate that the control mechanism of estrogen receptor ER尾 signaling pathway may be helpful to understand the regulation mechanism of estrogen receptor ER尾 signaling pathway by interacting with ER , which opens up a new way to elucidate the pathogenesis of breast cancer .

【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R737.9;R341

【共引文献】