HMGB1内化的分子机制及其生物学功能研究

发布时间：2018-01-18 06:41

本文关键词：HMGB1内化的分子机制及其生物学功能研究　出处：《第一军医大学》2006年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)是广泛存在于真核细胞中的一种含量丰富的非组蛋白，同源性高，在几乎所有的细胞类型中都有表达。HMGB1主要由三个结构域构成，包括两个HMG box结构(box A和boxB)和一个高度负电性的羧基末端结构域(C-terminal domain，CT)。最初发现其作为核因子直接参与基因表达调控，近年陆续发现其具有丰富的生物学功能，包括参与脑的发育和神经细胞生长、纤维蛋白溶酶原的活化、肿瘤细胞转移、免疫细胞分化以及广泛参与全身的炎症反应和组织损伤等。脓毒症仍然是目前临床危重患者的重要死因之一，其死亡率高达30～70％。过去十几年中临床利用肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)和白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)拮抗剂治疗都未取得满意效果，这是因为这些因子通常在发病早期释放，至晚期病人病情持续加重甚至死亡时，其水平已恢复正常。研究表明，HMGB1作为重要的晚期炎症介质在全身炎症反应过程中起重要作用。致炎刺激脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等激活的单核／巨噬细胞和内皮细胞经8～32h延迟后释放HMGB1，同时坏死组织细胞崩解也释放出大量的HMGB1。释放到细胞外的HMGB1分子通过进一步激活单核或内皮等细胞，引起大量炎症因子和黏附分子的表达和释放，导致并参与了包括脑组织、肺、胃肠道、关节、心脏等多种脏器的炎症损伤以及广泛的全身性炎症反应甚至死亡。由此可见，HMGB1在炎症反应过程中起着重要的中枢作用。 HMGB1参与炎症反应的分子基础及其相关信号过程一直是国内外的研究热点，近年来也取得了一些进展，但很多过程仍不明确，特别是HMGB1作用于细胞的信号机制。近年研究者们陆续鉴定出HMGB1的一些细胞表面受体，包括晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、toll样受体(toll-like receptor，TLR)家族成员以及α趋化因子受体，但阻断所有这些受体仍不能完全抑制HMGB1对细胞的作用，表明细胞表面可能还存在其它受体或其它可能的信号转导方式。HMGB1可以携带DNA载体进入哺乳动物细胞并有效表达，结合近年来人们陆续发现一些细胞因子、生长因子或它们的受体可以被细胞内化(internalization)而参与后续信号反应，我们推测HMGB1可能也可以被效应细胞内化，且其内化活性与其丰富的生物学功能密切相关。细胞和外界进行着广泛的物质交换。除一些小分子物质外，大多数生物大分子包括蛋白、多糖、多核苷酸以及一些病毒、细菌颗粒、坏死调亡细胞的产物都是通过内化的方式进入细胞，内化广泛参与人体各种生理和病理过程。内吞(endocytosis)是大分子物质内化的最重要的方式，是一个复杂的生物学过程，有多种信号通路参与，包含了广泛的蛋白与蛋白以及蛋白与脂质、糖类的相互作用。目前研究较清楚的特异性内化方式是经典的依赖包涵素的内吞途径(clathrin-dependent endocytosis)，即生物大分子在相应受体介导下通过形成有包涵素(clathrin)包被的小泡而被内吞，很多生物大分子包括低密脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、转铁蛋白(transferrin)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、胰岛素等都是通过受体介导的内吞作用进行的。近年来研究较多的另一种重要的内吞途径是非经典的不依赖包涵素的内吞途径，其中最重要的是胞膜窖(caveolae)介导的内吞。胞膜窖是细胞膜上脂筏(lipid raft)的一种，是细胞膜上的一块瓶颈形内陷的膜结构，富含胆固醇、神经鞘磷脂以及特征性蛋白—窖蛋白1(caveolin-1)。最初研究这个结构在细胞信号转导过程中起重要作用，近年发现其参与了多种细菌和病毒颗粒，如霍乱毒素(cholera toxin，CTx)和猿病毒40(simian virus 40，SV40)等的内化过程。硫酸肝素蛋白多糖(heparansulfate proteoglycan，HSPG)是广泛存在于细胞表面和基底膜的一类糖蛋白，由硫酸肝素(heparan sulfate，HS)和核心蛋白共价连接而成，它们作为共受体调节许多配体的特异性受体的激活，在细胞的机械支持、粘附、运动、增殖、分化和形态形成中起重要作用。除此之外，研究还表明HSPG在内化过程中也具有重要作用，可能是一种普遍的内化机制中的重要分子。基于以上认识，本研究首先将HMGB1与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)融合表达，通过荧光定位观察方法检测HMGB1是否具有内化活性；接着利用一系列与内化通路相关的抑制剂和荧光染料与带有绿色荧光的HMGB1蛋白共同孵育细胞，通过荧光共定位方法阐明HMGB1通过何种内化通路进行内化；之后在生物信息学基础上通过构建HMGB1上不同结构域片断与EGFP的融合表达载体，利用荧光显微镜研究介导HMGB1内化的功能域；进一步我们运用类似方法对鉴定出的HMGB1上可以有效内化的结构域—细胞因子诱导片段1(cytokine-inducing fragment 1，CIF1)的内化机制进行了研究；最后，我们在真核细胞中表达了HMGB1的EGFP融合蛋白，为后续进一步的深入研究打下基础。通过以上研究，我们得到了如下结论。第一、HMGB1以时间和能量依赖性方式通过内吞作用被哺乳动物细胞内化，内吞过程在15 min时已经开始，1 h左右达到平衡，内吞的HMGB1颗粒散在分布于细胞质内；第二、HMGB1可能通过与细胞膜表面HSPG的HS链相互作用，并在其特异性受体协助下，通过依赖胞膜窖的内吞途径进入细胞，之后内吞小泡在细胞骨架协助下在细胞内运动，融合蛋白最终进入细胞溶酶体；第三、HMGB1的CIF1段可以有效内化进入细胞，其内化机制与全长HMGB1基本一致，但其并不是该蛋白上唯一具有内化功能的片段，HMGB1上可能存在多个介导内化的功能域；第四、HMGB1可能通过内化介导了其刺激细胞释放炎症因子的功能。 HMGB1参与了失控性全身炎症反应的发生发展过程，并作为炎症反应后期重要的炎症因子，对病情转归起着关键作用。尽管已认识到HMGB1在脓毒症中具有关键作用，而且已经进行了一些研究，但其参与炎症反应作用机制的多个环节仍不清楚。本研究对HMGB1的内化机制进行了初步研究，且证实HMGB1可能通过内化介导了其刺激细胞释放炎症因子的功能。这些研究结果不但加深了我们对HMGB1生物学性质的认识，而且还有可能从根本上影响和改变临床上对脓毒症和失控性全身炎症的认识和治疗方案，因而具有极为重要的基础理论和临床治疗意义。
[Abstract]:High mobility group box ( 1 ) , which is widely present in eukaryotic cells , has high homology and is expressed in almost all kinds of cell types . The high mobility group box ( 1 ) is mainly composed of three domains , including two HMG box structures ( box A and box B ) and a highly electronegative carboxyl terminal domain ( CT ) . It has been found that it is directly involved in gene expression regulation as a nuclear factor , and has been found to have abundant biological functions in recent years , including the development of the brain and the growth of nerve cells , the activation of plasminogen , the metastasis of tumor cells , the differentiation of immune cells and the wide participation in systemic inflammatory response and tissue damage . The clinical use of tumor necrosis factor ( TNF ) and interleukin - 1 ( IL - 1 ) antagonist therapy in the past decade has not achieved satisfactory results . In recent years , some cellular surface receptors , including advanced glycosylation end products ( RAGE ) , toll - like receptor ( TLR ) family members and 伪 chemokine receptors , have been identified by researchers in recent years . In recent years , many biological macromolecules , including proteins , polysaccharides , polynucleotides and some viruses , bacterial particles and necrotic apoptotic cells , have been endocytosis by internalization . Many biological macromolecules include low density lipoprotein ( LDL ) , transferrin , epidermal growth factor ( EGF ) , insulin , etc . In addition , the research also shows that HSPG plays an important role in the process of internalization of HSPG , which may be an important molecule in the common internal mechanism . Based on the above - mentioned recognition , this study first expressed the fusion expression of the enhanced green fluorescent protein ( EGFP ) with enhanced green fluorescent protein ( EGFP ) , and then used a series of inhibitors and fluorescent dyes associated with the internalization pathway to co - incubate the cells with the GFP protein with green fluorescence . Then , we studied the internalization pathway by fluorescence co - localization method . At last , we used the similar method to study the internalization mechanism of cytokine - inducing fragment 1 ( CIF1 ) . Finally , we used the similar method to express the fusion protein of the protein - inducing fragment 1 ( cytokine - inducing fragment 1 , CIF1 ) . In the first part , we have obtained the following conclusions . First , in the time and energy - dependent manner , in the first case , the endocytosis is internalised by the mammalian cells , and the endocytosis reaches equilibrium at 15 min . The endocytosis is distributed in the cytoplasm ; secondly , it is possible to effectively internalize the endocytosis into the cell by the endocytosis of the membrane surface HSPG , but it is not the only fragment with the internalization function on the protein . This study has made a preliminary study on the mechanism of systemic inflammatory response and has been studied , but it has been recognized that the mechanism of inflammatory response plays a key role in the pathogenesis of sepsis .

【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R363

【参考文献】