应用膜反向斑点杂交技术快速鉴定分枝杆菌菌种和耐药结核分枝杆菌基因型

发布时间：2018-01-24 14:37

  本文关键词： 分枝杆菌 聚合酶链反应 单链构象多态性 菌种鉴定 反向斑点杂交　出处：《北京市结核病胸部肿瘤研究所》2005年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:建立一种简便、快速、灵敏、特异的分枝杆菌菌种鉴定方法,研究膜反向斑点杂交方法在快速鉴定分枝杆菌菌种方面的应用价值。 方法:通过16S rRNA聚合酶链反应(polymerase chain reaction,简称PCR)—单链构象多态性(single stranded conformation polymorphism,简称SSCP)分析253株分枝杆菌临床分离株;设计与合成用于鉴定分枝杆菌菌种的16S rRNA寡核苷酸探针,点于硝酸纤维素膜上。与待测的28种分枝杆菌标准菌株、9种非分枝杆菌和253株分枝杆菌临床分离株生物素标记的16S rRNA基因PCR产物进行反向斑点杂交。 结果:应用PCR—膜反向斑点杂交方法分析28种分枝杆菌标准菌株和9种非分枝杆菌菌株,结果显示寡核苷酸探针是特异的。253株分枝杆菌临床分离株中,经16S rRNA PCR-SSCP初步鉴定,198株为结核分枝杆菌复合群,经膜杂交,显示a1杂交阳性,两种鉴定方法结果一致:36株非结核分枝杆菌经膜杂交,11株鉴定为堪萨斯、瘰疬、胃、猿猴分枝杆菌,6株鉴定为胞内分枝杆菌,4株鉴定为耻垢分枝杆菌,3株鉴定为母牛分枝杆菌,3株鉴定为龟分枝杆菌,2株鉴定为戈登分枝杆菌,2株鉴定为偶发分枝杆菌,2株鉴定为结核分枝杆菌和胞内分枝杆菌复合感染株,1株鉴定为鸟胞内分枝杆菌复合感染株,1株鉴定为土分枝杆菌,1株鉴定为鸟分枝杆菌,另19株未出现分析探针阳性杂交。PCR-膜反向斑点杂交技术鉴定分枝杆菌菌种的灵敏度为92.49%,特异度为100%。 选用孔径为0.22μm的硝酸纤维素膜,选择各菌种特异性探针,探针终浓度为1.5pmol/μl,采用杂交温度42℃、杂交时间60分钟、45℃洗膜5分钟杂交结果较理想。 结论:影响杂交的主要因素是探针序列的组成、探针浓度、杂交和洗膜温度、洗膜时间等。PCR-膜反向斑点杂交技术可简便、快速、特异地鉴定分枝杆菌菌种,仅需2天时间。
[Abstract]:Objective : To establish a simple , rapid , sensitive and specific method for the identification of Mycobacterium tuberculosis strains . Methods : The 16S rRNA oligonucleotide probes were analyzed by 16S rRNA polymerase chain reaction ( PCR ) - single strand conformation polymorphism ( SSCP ) . Results : The PCR - membrane reverse dot blot was used to analyze 28 strains of Mycobacterium tuberculosis and 9 strains of non - Mycobacterium tuberculosis . The results showed that the oligonucleotide probe was a specific strain of Mycobacterium tuberculosis . A cellulose nitrate membrane with pore size of 0.22 渭m was selected , the specific probes were selected , the final concentration of the probe was 1.5 pmol / 渭l , the hybridization temperature was 42 鈩，

本文编号：1460280