西尼罗病毒多表位疫苗研究

发布时间：2018-02-01 10:15

本文关键词： 西尼罗病毒多表位基因疫苗密码子优化免疫保护作用　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2007年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 西尼罗病毒(West nile virus，WNV)属虫媒病毒科黄病毒属，能引起人畜共患性疾病。1937年该病毒首次在乌干达西尼罗河地区一个发热妇女的血液中分离到并因此得名。其后在非洲、中东、中亚和西欧等地区先后有西尼罗病毒感染的报道，涉及数十个国家和地区。上世纪90年代以来，爆发感染的地区明显增加。1999年西尼罗病毒开始在美国纽约地区发生爆发性大流行，随后向各地蔓延。据美国疾病控制与预防中心报道，2004年美国共发生西尼罗病毒感染9175人，其中有230人已死亡。到目前为止，针对西尼罗病毒感染仍无有效的治疗方法，真正用于预防西尼罗病毒的疫苗主要为灭活疫苗，且仅限于在马群中应用。表位(epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称抗原决定簇(antigenic determinant)。它是T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)和B细胞抗原受体(B cell receptor，BCR)与抗体特异结合的基本单位。在免疫应答中，TCR和BCR所识别的抗原表位不同，分别被称为T细胞表位和B细胞表位。作为理想的免疫原，抗原分子中应同时包含目的抗原B细胞表位和自身或外源T细胞表位，才能诱导出高度特异性的体液及细胞免疫反应，从体液免疫和细胞免疫水平起到预防或治疗作用，赋予较广泛的保护性。表位疫苗是近年来病毒新型疫苗研究的热点。目前关于西尼罗病毒多表位疫苗的研究尚未见报道。基于此，本研究在西尼罗病毒多表位疫苗方面进行了探索性研究。在对西尼罗病毒全基因序列进行比对分析的基础上，确定可能作为表位的基因序列，并通过串联方式进行连接得到多表位基因，同时对该序列进行密码子优化。利用原核表达载体系统，观察多表位基因的表达情况及其重组蛋白在家兔体内的免疫原性。在此基础上，构建含有西尼罗病毒多表位基因的真核重组质粒DNA，并采用多种方式对小鼠进行免疫，观察其诱导免疫应答水平的能力和差异，为研制具有高免疫原性的西尼罗病毒多表位核酸疫苗提供依据。首先，我们利用生物分析软件对西尼罗病毒China 01株全基因序列进行分析，得出可作为抗原表位的不同基因序列，结合文献确定目的基因(M)由4个表位序列(分别编码C蛋白第98-106 AA，，PrM蛋白第73-91 AA，E蛋白第307—332 AA，NS1蛋白第252-260 AA)和3个连接肽基因组成，共计210个碱基。分别采用原核表达常用密码子和哺乳动物偏好密码子对该基因序列进行优化，使之适合于原核细胞和真核细胞表达。其次，通过重叠PCR方法扩增该基因片段，得到多表位基因cDNA分子。将扩增产物克隆到原核表达载体pET-43a(+)，获得重组质粒pET-43-M。将原核重组质粒pET-43-M导入大肠杆菌中进行表达，表达的融合蛋白Nus-M经SDS—PAGE电泳后进行免疫印迹检测。检测结果显示，重组质粒pET-43-M可在原核细胞中大量表达，表达产物具有特异的西尼罗病毒抗原性。原核表达的Nus-M蛋白经过纯化、定量后，混合弗氏佐剂，采用多点皮下注射方式免疫白兔，免疫间隔为2周，共免疫3次，每次每只500μg。应用ELISA方法和间接免疫荧光法检测抗体产生情况和效价。结果显示，在第二次免疫后，兔体内已经产生针对Nus-M蛋白的抗体，在第三次免疫后达到高峰，以后逐渐下降。免疫结果显示，重组蛋白能诱导产生特异性的高效价抗体。第三，利用真核表达载体pcDNA3.1构建西尼罗病毒真核重组质粒pcDNA—M。将重组质粒pcDNA—M转染BHK21细胞，采用RT-PCR方法检测到重组质粒在真核细胞内转录，间接免疫荧光法在细胞胞浆中检测到西尼罗病毒的特异蛋白抗原，表明真核重组质粒可在真核细胞内表达，并且表达产物具有西尼罗病毒抗原性。第四，进一步观察西尼罗病毒多表位基因重组质粒DNA的免疫反应性，同时比较重组质粒DNA免疫、初始DNA免疫加重组蛋白加强和DNA加佐剂免疫等不同免疫方式诱导免疫应答反应的差异。结果显示，三种免疫方案均能诱导小鼠产生针对西尼罗病毒的特异性中和抗体，中和抗体效价分别达到1∶52、1∶85和1∶90．重组蛋白加强和免疫佐剂均能有效提高重组质粒诱导体液免疫应答反应。进一步分析细胞免疫反应证实，重组质粒DNA组、初始DNA免疫加重组蛋白加强组和加免疫佐剂组均能够诱导小鼠产生特异性细胞免疫，各组小鼠脾细胞经过CoA刺激后，其特异性CTL杀伤率分别达到18.9％(E／T=20／1)、32.1％(E／T=20／1)和47.7％(E／T=20／1)，刺激指数分别为4.10±1.34、3.80±0.12和7.81±0.13，明显高于对照组。第五，病毒攻击观察重组西尼罗病毒多表位基因疫苗的免疫保护作用。取经不同免疫途径免疫后的BALB／C小鼠，分别在每只小鼠颅内注射100 LD_(50)的西尼罗病毒悬液，然后连续观察2周，统计各组死亡数并计算保护率。结果显示，初始DNA免疫加重组蛋白加强组和DNA加佐剂组保护率高，达到62.5％，重组质粒DNA组保护率为50％，而单纯采用重组融合蛋白免疫组保护率最低，只有25％。这些结果表明，重组的西尼罗多表位基因疫苗对防止西尼罗病毒感染具有较好的保护作用。本研究表明，构建的西尼罗病毒多表位基因疫苗能够刺激动物产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应，对西尼罗病毒感染具有保护作用，为进一步研发高效价的西尼罗病毒多表位疫苗奠定了基础。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

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