人高迁移率族蛋白突变体的制备及其功能的初步研究

发布时间：2018-02-06 06:52

本文关键词： HMGB1 基因克隆原核表达蛋白纯化激光共聚焦致炎因子竞争性抑制　出处：《第三军医大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 严重烧伤、创伤可以诱发机体初期的炎症反应,但由于机体产生的多种炎症介质形成的瀑布效应,可以使炎症反应扩大甚至失去控制,最终导致以细胞自身性破坏为特征的全身性炎症反应。脓毒症是由机体过度炎症反应或炎症失控所致。脓毒症、脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(Multiple Organ Dysfunction Syndrome, MODS)是反映机体内一系列病理生理改变及临床病情严重程度变化的动态过程,实质是全身炎症反应综合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome, SIRS)不断加剧、持续恶化的结果。糖皮质激素、抗内毒素抗体、肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor, TNF)拮抗剂,白介素-1(Interleukin-1β, IL-1)受体拮抗剂等被认为能阻断这种炎症“连锁反应”。但多项临床实验证实,抗炎症治疗并没有达到预期效果。其原因在于大多数致炎因子在发生炎症反应的6个小时内即已经释放并达高峰(这些致炎因子被称为早期炎症因子、如TNF、IL-1、IL-6等),故针对这些早期炎症因子的临床治疗窗口期相当窄,稍一延迟其治疗效果就会大大降低,甚至根本无效。于是,研究者们致力于寻找晚期致炎因子。1999年,Wang等首次报道高迁移率族蛋白(high mobility group box-1 protein,HMGB1)可能作为一种晚期炎症介质参与了脓毒症的发病过程。HMGB1是一种在真核细胞中广泛表达并且高度保守的蛋白。它首先是作为一种DNA结合蛋白而被发现的,对正常转录调节和基因表达起重要作用的结构因子。研究发现,HMGB1能被激活的免疫细胞(如巨噬细胞、单核细胞)释放到细胞外,作为潜在的致炎因子,介导脓毒症的发生,而且更有意义的是HMGB1是一种重要的全身炎症反应晚期炎症介质。这提示了HMGB1的治疗窗口期比其它早期炎症因子更宽,相对于肿瘤坏死因子(TNF)在受到刺激后数分钟就产生了,其循环浓度在疾病进展的头几个小时就达到基础水平,HMGB1在受到刺激后大约20小时后才由巨噬细胞分泌。因此其治疗窗口期更宽,使得该分子成为防治全身性炎症及脓毒症的措施中极具吸引力一个重要靶标。目前针对HMGB1的抗炎制剂主要有两种,抗HMGB1抗体和乙基丙酮酸盐。然而抗HMGB1抗体在用于人体时,需使用人源化抗体,否则将会导致人抗异源性抗体反应,甚至过敏反应;乙基丙酮酸盐抑制HMGB1释放的具体机制尚不清楚,且其大量静脉应用时的毒性反应还需探讨。由此可见,上述两类HMGB1抑制剂都还有很多不足之处,因此,除了对这两类抑制剂进行完善外,还需发展新型HMGB1抑制剂。基于以上分析,本实验构建了人HMGB1的六个突变体,成功制备并纯化了HMGB1蛋白及其六个重组HMGB1突变体蛋白,根据各突变体蛋白与受体结合情况及其致炎效应,筛选出只与受体结合而不能诱发炎症反应的突变体并检测其对HMGB1炎症效应的竞争性抑制作用。本研究旨在制备并寻找能竞争性抑制HMGB1致炎效应的突变体,为进一步研究和开发新型抗炎治疗候选制剂奠定基础。目的: 构建HMGB1的六个突变体,从中筛选出能与靶细胞膜上受体结合但没有致炎效应的突变体蛋白,并检测其在体外竞争性抑制HMGB1致炎效应的作用。材料与方法: 1、人HMGB1的克隆取人新鲜扁桃体组织,按Tripure试剂说明提取总RNA,。根据GenBank中编码人HMGB1的cDNA序列,设计一对特异性引物。按试剂盒说明进行RT-PCR。纯化回收RT-PCR产物。将RT-PCR产物连接于pUC18质粒,重组质粒命名为pUC18/HMGB1,然后由上海生工公司进行序列测定。 2、人HMGB1突变体的构建根据突变位点设计六对引物,以重组质粒pUC18/HMGB1为模板,一步反向PCR致突变法构建人HMGB1突变体,重组质粒分别命名为: pUC18/HMGB1 M1 , pUC18/HMGB1 M2 , pUC18/HMGB1 M3 , pUC18/HMGB1 M4, pUC18/HMGB1 M5, pUC18/HMGB1 M6。然后由上海英骏公司进行序列测定。 3、表达载体的构建酶切质粒pUC18/ HMGB1、pUC18/HMGB1 M1、pUC18/HMGB1 M2、pUC18/HMGB1 M3、pUC18/HMGB1 M4、pUC18/HMGB1 M5、pUC18/HMGB1 M6,回收目的片断并连接于原核表达载体pQE-80L。经酶切鉴定得到重组原核表达载体,分别命名为:pQE-80L/HMGB1、pQE-80L/HMGB1 M1、pQE-80L/HMGB1 M2、pQE-80L/HMGB1 M3、pQE-80L/HMGB1 M4、pQE-80L/HMGB1 M5、pQE-80L/HMGB1 M6。 4、目的蛋白表达、鉴定将构建的重组表达质粒转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导蛋白表达,并行SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。再经蛋白质免疫印迹(Western Blotting)鉴定表达的目的蛋白。 5、目的蛋白的分离纯化收集经IPTG诱导后的细菌,将超声碎菌离心后的上清过Ni~(2+)-NTA柱纯化目的蛋白。 6、激光共聚焦将THP-1细胞作为HMGB1的靶细胞,取生长至对数生长期的THP-1细胞适量分别与纯化的M1-M6六种突变体蛋白孵育一定时间,同时加入多粘菌素B排除LPS干扰,设阳性对照(HMGB1蛋白)和阴性对照(PBS)。固定、封闭后依次分别加入一抗稀释液(羊抗人HMGB1一抗)、FITC标记二抗稀释液(FITC标记兔抗羊抗体),置激光共聚焦显微镜下观察细胞膜上荧光。 7、IL-1βELISA实验将生长至对数生长期的适量THP-1细胞共分为8个组:1-6组中分别加入M1-M6六种蛋白,7组为阳性对照(HMGB1蛋白),8组作为阴性对照(PBS)。每组分别于2h、4h、6h、8h四个时相点收集加入不同蛋白的THP-1细胞悬液上清,按IL-1βELISA试剂盒说明书行ELISA。 8、竞争性抑制实验将生长至对数生长期的适量THP-1细胞分组。除阴性对照组(PBS),其余各组均加入HMGB1蛋白。再分别加入由IL-1βELISA实验筛选得到的只与受体结合而不诱导炎症因子释放的突变体蛋白,即HMGB1 M1、M2、M3、M5、M6。分别于2h、4h、6h、8h四个时相点收集各孔中细胞悬液上清,按IL-1βELISA试剂盒说明书行ELISA。将筛选出的竞争性抑制作用较强的突变体M1、M2分别行竞争性抑制实验,收集的样本行TNF-αELISA实验,验证IL-1β的结果。结果: 1、经RT-PCR成功克隆了编码人HMGB1氨基酸的cDNA,片断长为648bp。经序列比对,与GenBank中报道的已知序列完全一致。 2、以获得的pUC19/HMGB1为模板,经一步反向PCR法成功构建了HMGB1的六个突变体。经序列测定,与预期设计相符。 3、重组表达质粒pQE-80L/HMGB1、pQE-80L/HMGB1 M1、pQE-80L/HMGB1 M2、pQE-80L/HMGB1 M3、pQE-80L/HMGB1 M4、pQE-80L/HMGB1 M5、pQE-80L/HMGB1 M6经酶切后可见648bp大小片断,酶切结果表明表达质粒构建成功。 4、经IPTG诱导蛋白表达后,SDS-PAGE分析可见,目的蛋白大小约为30kDa。经Western Blotting证实,在30kDa处有明显蛋白条带。 5、目的蛋白经Ni~(2+)-NTA柱纯化后,纯化的蛋白在SDS-PAGE上30kDa处呈现一条带,证明该目的蛋白得到有效纯化。 6、激光共聚焦实验显示与阴性对照组相比,分别加入M1-M6六个突变体蛋白的THP-1细胞膜上均可见明显绿色荧光。说明六种突变体蛋白均能与靶细胞THP-1细胞膜上受体结合。 7、IL-1βELISA实验表明六个突变体中,M4组细胞上清中IL-1β含量显著高于阳性对照组,其余突变体都在某些时相点都低于阳性对照组,因此排除突变体M4。 8、竞争性抑制实验提示加入HMGB1 M6组在各时相点,其细胞上清中IL-1β含量都明显高于阳性对照组(HMGB1);其余各突变体HMGB1 M1、HMGB1 M2、HMGB1 M3、HMGB1 M5在2h-6h细胞上清中IL-1β含量与阳性对照组没有明显差异(P0.05),但在6h-8h均能有效抑制HMGB1诱导IL-1β的表达。其中M2竞争性抑制作用最强,在6h和8h均明显低于阳性对照组(P0.05)。将筛选出的竞争性抑制作用较强的M1、M2两个突变体分别行竞争性抑制实验后,TNF-αELISA实验提示,加入M1、M2的两组TNF-α的含量在各时相点都低于阳性对照,其中M1在8h时THP-1细胞上清中TNF-α的量显著低于阳性对照组(P0.05),M2在6h-8h细胞上清中TNF-α的量显著低于阳性对照组(P0.05)。结论: 本实验在成功制备、纯化HMGB1蛋白及其六个重组HMGB1突变体蛋白的基础上,通过细胞免疫荧光标记的方法,激光共聚焦显微镜筛选出能与THP-1细胞膜上受体结合的突变体,即HMGB1 M1-M6。通过ELISA筛选出能与受体结合却没有致炎效应的突变体,即HMGB1 M1、M2、M3、M5、M6。竞争性抑制实验进一步筛选出能在体外有效竞争性抑制HMGB1致炎效应的突变体,即HMGB1 M1、M2、M3、M5,并得到竞争性抑制作用最强的突变体HMGB1 M2。有望为抗炎治疗提供新型候选制剂。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R341

【参考文献】