利用优化后的杆状病毒转导方法构建人乳头瘤病毒假病毒体外感染模型

发布时间：2018-02-14 06:58

  本文关键词： 杆状病毒 哺乳动物细胞 基因转移载体 人乳头瘤病毒 病毒滴度　出处：《厦门大学》2006年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： HPV感染是常见的性传播疾病,与宫颈癌及泌尿生殖道相关癌症的发生关系密切,严重危害人类健康。开发安全有效的HPV预防疫苗有望消灭或显著降低HPV感染造成的危害,具有十分重大的社会意义。我实验室正在研究开发HPV基因工程疫苗,迫切需要可简便有效对候选疫苗的保护性进行评估的方法。目前的HPV体外感染模型在实验周期、稳定性、滴度等方面存在各自的缺点,而新型实验技术平台的发展为构建更有效的感染模型提供了有利条件。杆状病毒近几年来被发现可作为一种对哺乳动物细胞的新型基因转移载体,相比其它基因转移方法具有许多独特的优势。本论文即探讨了应用重组杆状病毒在哺乳动物细胞中构建HPV假病毒的可行性。为了更有效的获得HPV假病毒本论文对重组杆状病毒对哺乳动物细胞的基因转移方法进行了研究,建立了更为简便、快捷且高效的基因转移方法。该方法被成功用于建立了有效的HPV16假病毒体外感染模型,以及鉴定杆状病毒滴度的新方法。 本研究利用Bac-to-Bac系统、增强型绿色荧光蛋白EGFP和CMV-T7联合启动子构建对哺乳动物细胞的杆状病毒基因转移载体,首先探讨了直接使用重组杆状病毒感染后的昆虫细胞培养上清对哺乳动物细胞进行基因转移的可行性。将重组杆状病毒感染4d后的Sf-9细胞培养上清(≥1.0×10~7PFU/mL)直接与HepG2细胞37℃作用12h,可获得高于95%的基因转移效率,证明了重组杆状病毒感染后的昆虫细胞培养上清可直接用于高效转导哺乳动物细胞。通过对转导时间和稀释比例的优化,显示用哺乳动物细胞培养基等体积稀释后的带毒上清可兼具高效和低损伤的特点。应用上述结果本研究首次提出并初步建立了重组杆状病毒上清转导法。该方法与脂质体、重组逆转录病毒、重组痘苗病毒进行的对比显示其具有高效、低毒的优点。应用该方法对27种不同类型及组织来源的哺乳动物细胞进行基因转移实验,包括16种人类组织细胞、9种啮齿类组织细胞和2种猴组织细胞,结果显示该方法具有较好的适用性,可有效转导大多数哺乳动物细胞。并发现重组杆状病毒对灵长类来源细胞的基因转移效率显著高于对啮齿类来源细胞,对贴壁细胞的基因转移效率显著高于对悬浮细胞。 结合最新的研究进展,本研究进一步对病毒上清转导法的实验条件进行摸索优化,并尝试采用新方法提高转导效率。对使用不同的稀释缓冲液和转导温度的研究结果显示,以PBS作为稀释缓冲液在27℃下进行转导可显著提高转导效率。在PBS环境中对比不同转导时间和稀释比例以及不同血清含量对转导效果的影响结果显示,转导效率与转导时间和病毒用量均呈正相关,并首次发现PBS中存在血清成分不利于提高转导效率。应用不同浓度丁酸钠增强表达的实验结果显示,0.5～1mM的丁酸钠较为合适于在CV1细胞中提高杆状病毒载体的表达效率,更高浓度的丁酸钠对细胞有明显毒性。本研究首次在杆状病毒转导哺乳动物细胞中使用离心方法,结果显示通过600g水平离心1h即可获得高水平的转导和表达效率,优于在PBS环境中27℃孵育8h的效果,并进一步对离心时间、离心后孵育时间、缓冲液进行了摸索优化。 应用上述结果本研究首次提出并建立了重组杆状病毒上清离心转导法。病毒上清以PBS为缓冲环境600g水平离心1h进行转导的方法可在获得高转导效率的同时显著缩短实验时间,提高了实验效率。该方法具有简便、快捷和高效的特点,并可作为一种常规操作方法用于日常实验。本研究同时探讨了辅助感染可表达T7 RNA聚合酶的重组痘苗病毒VV-T7RP对表达的影响,显示辅助感染VV-T7RP可显著增强带有CMV-T7联合启动子的重组杆状病毒的表达效果,表明将重组痘苗病毒VV-T7RP与重组杆状病毒结合可建立一种高效瞬时表达方法。 本研究首次设计构建了可同时在哺乳动物细胞中表达HPV16L1和L2蛋白的重组杆状病毒,并采用本研究建立的重组杆状病毒上清离心转导法,探讨了通过重组杆状病毒转导方法在哺乳动物细胞中表达组装HPV16假病毒的可行性。细胞感染实验和透射电镜观察结果证实,通过该方法成功获得了具有感染能力的HPV16假病毒。应用已被证实的4株HPV16单抗,证明该假病毒感染模型可应用于进行中和实验。应用该模型,从本实验室构建的18株HPV16单抗中筛选获得2株中和单抗3D10和PD1,同时证明本实验室构建的候选基因工程疫苗HPV16 VLP可激发Balb/c小鼠产生具有中和能力的保护性体液免疫。该模型的成功建立为HPV16中和抗体的筛选和HPV16预防疫苗的研究提供了必要的条件和有力的支持,也为进一步构建其它型别的HPV假病毒体外感染模型提供了基础。本研究还首次尝试了使用HPV16假病毒对昆虫细胞的感染实验,显示HPV16假病毒可能具有将核酸导入昆虫细胞的能力。 大量的关于重组杆状病毒表达系统的应用研究实践显示,准确测定病毒滴度对于保持蛋白生产和研究实验的稳定性是十分重要的。本研究综合了应用重组杆状病毒上清离心转导法可高效转导哺乳动物细胞的特点以及辅助感染VV-T7RP可显著增强CMV-T7联合启动子表达水平的特点,提出了新型的可在哺乳动物细胞中测定重组杆状病毒滴度的方法。本研究设计构建了同时具有在昆虫细胞中和哺乳动物细胞中高效表达报告基因的重组杆状病毒。应用该病毒首先在昆虫细胞中准确测定滴度,再通过梯度稀释后离心转导CV1细胞并辅助感染VV-T7RP,在12～24h后直接观察细胞发光情况,以TCID_(50)方法计算病毒滴度。结果显示,以CMV-T7联合启动子引导的EGFP报告基因表达元件在VV-T7RP辅助下具有最高的检测灵敏度,其测得的滴度与昆虫细胞中测得的滴度相当,优于单独使用CMV启动子或T7启动子。本研究首次提出了可将CMV-T7-EGFP表达元件作为一种优良的病毒滴度鉴定元件克隆于杆状病毒载体上,其在昆虫细胞中不会进行有效表达和干扰重组蛋白和病毒的生产,同时又可在哺乳动物细胞中进行高灵敏度和快速、直观的检测,不需要使用流式细胞仪进行分析。该方法为重组杆状病毒滴度的测定提供了一种选择。
[Abstract]:HPV infection is a common sexually transmitted disease , which is closely related to the occurrence of cervical cancer and related cancers of the urinary tract . It is of great social significance to develop a safe and effective HPV vaccine to prevent or significantly reduce the risk of HPV infection . In this study , the gene transfer efficiency of recombinant baculovirus was investigated . The results showed that the gene transfer efficiency of recombinant baculovirus was higher than that in HepG2 cells . In this study , the effect of different signal transduction time and dilution ratio and different serum levels on the transduction efficiency was studied . The results showed that the transfection efficiency was positively correlated with the time of transduction and the dosage of virus . The results showed that the transfection efficiency was better than that in PBS . The results showed that 0.5 锝，

本文编号：1510132