合成成骨生长肽对大鼠及人骨髓基质干细胞的促成骨作用及其机制的研究

发布时间：2018-02-17 02:08

  本文关键词： 成骨生长肽(OGP) 骨髓基质干细胞(BMSCs) 成骨 增殖 促有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)　出处：《复旦大学》2006年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的：成骨生长肽(OGP)是一种在哺乳动物体内广泛存在的由14个氨基酸组成的多肽。其序列已测定。我们在体外人工合成了成骨生长肽，已经发现它在体内和体外具有明显的促成骨作用。骨髓基质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的成体干细胞，具有多向分化能力。本实验前两部分研究了合成成骨生长肽(sOGP)对体外培养的大鼠及人BMSCs增殖和分化的影响，以验证sOGP的促成骨作用是否是通过其对BMSCs的作用实现的。既往的研究显示OGP受体属于一种G蛋白耦联受体(GPCRs)，而MAPK信号传导通路是GPCRs重要的下游信号通路之一，实验第三部分即研究了MAPK家族中三个主要成员：ERK、JNK、p38激酶在sOGP作用后的表达变化，以研究sOGP作用的细胞内分子机制。 方法：实验第一部分研究了不同浓度的sOGP对大鼠BMSCs增殖和向成骨方向分化的影响。采用贴壁法分离培养大鼠BMSCs。采用倒置显微镜和电子显微镜观察sOGP作用后细胞形态的变化。采用MTT法测量各组细胞增殖率并绘制生长曲线，以研究sOGP对细胞增殖的作用。采用RT-PCR、化学测量、组织化学及免疫组织化学染色等方法，在mRNA和蛋白两个水平检测碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原(COLⅠ)、骨钙素(OC)等成骨标志物的表达，并与经典的成骨诱导剂地塞米松相对比，进行定量分析。 实验第二部分进一步研究了sOGP对人BMSCs增殖和向成骨方向分化的影响。采用密度梯度离心和贴壁分离法相结合获得了比较均一的人BMSCs。对细胞形态观察、细胞增殖率和成骨标志物表达的检测方法与第一部分相同，并比较了sOGP对大鼠和人BMSCs作用的异同。 实验第三部分研究了sOGP作用后，人BMSCs细胞内MAPK家族中三个主要成员的表达变化。采用Western-blot方法检测了sOGP作用后第1、2、4、6、8、10、12、14、16天时，ERK、JNK、p38激酶及其磷酸化激活形式的水平变化。采用ERK1／2通路特异性的阻断剂U0126预处理细胞后，观察对sOGP促成骨作用的影响。 结果：加入sOGP后，大鼠BMSCs形态发生明显变化，随着培养时间延长，可见有致密的细胞结节和骨小梁样结构出现，电镜观察显示细胞处于功能活跃状态。sOGP对大鼠BMSCs增殖的影响随浓度不同而显示出轻度抑制和轻度促进的作用，其中在10~(-9)mol／L时，抑制作用最明显。而RT-PCR发现sOGP作用后细胞内三种成骨标志物的mRNA都有表达，而ALP测量和细胞染色结果则显示了ALP和COLⅠ在蛋白水平的表达以及钙结节的存在，结果定量分析显示，在sOGP浓度为10~(-9)mol／L时成骨标志物的表达水平最高，显示出最强的促成骨能力，并强于地塞米松对照组。 sOGP对人BMSCs的作用与大鼠不尽相同，虽然也有形态上的明显变化并形成细胞结节，但没有骨小梁样结果出现，电镜观察也提示细胞处于功能活跃状态。sOGP对人BMSCs增殖的作用也受浓度影响，基本上是轻度促进作用，，其中在10~(-9)mol／L时，促进作用最明显。RT-PCR、细胞染色和ALP测量也证实了成骨标志物的表达，定量分析也以10~(-9)mol／L浓度组促成骨能力最强，并强于地塞米松对照组。 sOGP作用后，Western-blot检测发现，细胞内ERK1／2的表达在各时间点没有明显变化，但其磷酸化激活形式在第2天左右开始升高，第4天达到峰值(比基线水平高出约5—6倍)，6天后逐渐降至基线水平，而这一时期正是细胞向成骨方向转化的关键时期。p38的总量也没有明显变化，而磷酸化的p38约在第8天左右开始升高，10天左右达到峰值(比基线水平高约3倍)，12后降至基线水平。JNK的表达则没有明显变化。采用U0126预处理细胞，特异性阻断ERK1／2的作用后发现sOGP促进细胞ALP表达的作用几乎完全被阻断，而脂肪染色则显示细胞发生了向脂肪方向的转化。 结论：1．合成成骨生长肽(sOGP)对大鼠和人骨髓基质干细胞(BMSCs)均有明显的促成骨作用。这种作用的强弱与sOGP的浓度密切相关，在10~(-9)mol／L浓度下，其促成骨作用最强。 2．合成成骨生长肽(sOGP)对大鼠和人骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖的作用随浓度不同而不同，分别表现为轻度促进和轻度抑制的作用。 3．ERK1／2信号传导通路在sOGP诱发的BMSCs向成骨方向转化的过程中起着重要作用。阻断ERK1／2通路可以阻断sOGP的这种促成骨作用，而使BMSCs发生向成脂肪方向的转化。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R341

【引证文献】

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1 米尔萨力江·亚森;郭常军;费琴明;陈统一;崔大敷;;基因芯片分析成骨生长肽对OPG~(-/-)小鼠骨髓间充质干细胞的作用[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年27期

本文编号：1516972