高致病性猪繁殖与呼吸综合征病理学研究及其病毒的序列分析

  本文关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病理学研究及其病毒的序列分析，，由笔耕文化传播整理发布。

《内蒙古农业大学》 2010年

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病理学研究及其病毒的序列分析

刘永宏  

【摘要】： 猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起猪的一种传染病,表现为母猪生殖衰竭和仔猪、成年猪呼吸困难,是影响养猪业最大的传染病之一。PRRSV属于动脉炎病毒科成员,基因组长度约为15kb～15.5kb,至少含有9个开放阅读框架,编码20种以上成熟的蛋白质。根据基因型和抗原性的差异将PRRSV分为北美洲型和欧洲型两种,各自代表株分别为VR-2332株和LV株。2006年在中国暴发了空前规模巨大的猪高热症,感染猪达200万头以上,至少40万头死亡,这给中国经济带来巨大的损失,也严重威胁了全球养猪业和世界公共卫生。 本研究为了分析猪高热症的真正原因,通过对北京各郊区县和周边地区15个猪养殖场(户)55个病例进行发病情况、流行病学调查和临床症状观察,以及通过对发病猪和病死猪剖检、病理组织学观察、免疫组化染色和电镜观察,同时对冰冻病料和血清做了核酸和抗体检测。研究结果表明:PRRSV核酸阳性率为60%,猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2, PCV-2)核酸阳性率为32.7%,PRRSV和PCV-2混合感染率为18.2%;此次猪高热症的主要病原是PRRSV,发病特点不同于以往典型的PRRS,同时有PCV-2的混合感染;PRRS病理组织学病变群主要为间质性肺炎、非化脓性脑炎、出血性坏死性淋巴结炎、急性炎性脾肿、变质性心肌炎、急性间质性肾炎伴随肾病和出血、坏死性扁桃体炎、母猪子宫内膜炎、变质性肝炎和肝细胞可见胞浆内嗜酸性包涵体;PRRSV阳性脏器为肺脏、脾脏、淋巴结、扁桃体、脑、肝脏、肾脏、肾上腺、胃肠和心脏;PRRSV阳性细胞为单核-巨噬细胞、黏膜上皮细胞、淋巴细胞、血管内皮细胞、腺上皮细胞(肺上皮细胞、肝细胞、肾小管上皮细胞等)、杯状细胞、纤维细胞、成纤维细胞、心肌细胞、神经细胞、胶质细胞和软骨细胞。 为了分析此次疫情高发病率和高死亡率的原因,本研究将4份没有接种PRRS疫苗RT-PCR鉴定为单一PRRSV阳性的病料,接种MARC-145细胞进行病毒分离,经RT-PCR、IFA和电镜鉴定,表明分离到4株病毒且均为PRRSV,其TCID50均为10-6.5/0.1mL,命名为BJSY-1、BJPG、BJSD和BJBLZ株。进一步设计了相互重叠的16段引物,RT-PCR产物直接纯化、测序和拼接,得到4株PRRSV的全基因序列,运用分子生物学软件进行比对和遗传演化分析,结果显示:本研究分离的BJSY-1、BJPG、BJSD和BJBLZ株基因全长分别为15319nt、15315nt、15345nt和15316nt,通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)的审核,GenBank登录号分别为FJ950744、FJ950746、FJ950747和FJ950745;本研究的4株与北美洲型毒株核苷酸同源性在83.3%～99.4%之间,与欧洲型毒株核苷酸同源性只有58.3%左右,均属于北美洲型亚群Ⅱ,且属于HP-PRRSV;ORF6基因与北美洲株同源性和欧洲株同源性均最高,其次是ORF2基因,再次是ORF7、ORF4和ORF5基因,同源性最低的是ORF3基因。 本研究选择了HP-PRRSV BJSY-1株变异性最小的ORF6基因,设计合成了一对特异性引物,扩增ORF6基因片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),重组质粒pET-ORF6转化BL21宿主菌后,鉴定构建成功后摸索合适条件诱导表达M蛋白,纯化回收得到了可溶性的具有免疫学反应活性的融合蛋白HIS-M,分子量约为39kDa。本研究得到了一种稳定的、免疫原性好的抗原,为制备单抗或作为检测抗原奠定了基础。 考虑到PRRSV抗体和抗原双阴性猪不易获得,试图寻找一种标准的且对PRRSV易感的实验动物代替猪来研究PRRSV,同时为了验证致病力增强的HP-PRRSV BJSY-1毒株是否可以感染其它动物。本研究对BALB/c小白鼠和日本大耳白兔进行了不同剂量的人工感染实验,攻毒后观察体温、体重等变化,按照实验设计定期剖检取材进行PRRSV核酸检测和病理学检查。结果显示:小白鼠和兔体温、体重等无异常变化,PRRSV核酸检测阴性,没有出现PRRSV特异的病理组织学变化。本研究证实了HP-PRRSV不感染BALB/c小白鼠和日本大耳白兔。

【关键词】：
【学位授予单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：S858.28
【目录】：

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