高迁移率族蛋白B1对小鼠调节性T细胞免疫功能的影响及机制研究

发布时间：2018-03-09 01:33

本文选题：高迁移率族蛋白B1　切入点：调节性T细胞　出处：《第三军医大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的:高迁移率族蛋白B1(HMGB1)作为一种晚期炎症介质,介导了脓毒症和其他系统性炎症的致死性。本实验拟通过观察体外刺激小鼠调节性T细胞相关指标的表达变化规律,进而阐明HMGB1对该细胞免疫功能的影响并对其机制进行初步探讨。旨在为进一步体内实验及感染后期严重脓毒症的预防和治疗提供新思路。方法:断颈处死小鼠无菌取脾脏,分离单个核细胞。①采用免疫磁珠法分离获取正常BALB/c小鼠脾脏CD4~+T,CD4~+CD25~-T细胞及CD4~+CD25~Treg,鉴定细胞纯度。②分别以植物凝集素(PHA)、刀豆素A(Con A)及固相包被抗-CD3这三种不同的刺激剂诱导活化Treg,观察T淋巴细胞毒性相关抗原4(cytotoxic Tlymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4)及叉头翼状螺旋转录因子(forkhead/wingedhelix transcription factor,Foxp3)表达的时间-效应关系。③将Treg依HMGB1(100ng/ml)刺激时间不同设为24 h组、48 h组、72 h组观察HMGB1刺激与CTLA-4及Foxp3表达的时间-效应关系。将Treg依HMGB1浓度不同设为0ng/ml组(对照组)、10ng/ml组、100ng/ml组、1000ng/ml组,72h后用流式细胞仪分析CTLA-4、Foxp3表达情况及对IL-10分泌的影响(剂量-效应关系)。④分别提取CD4~+CD25~+Treg及CD4~+CD25~-T细胞,设单纯CD4~+CD25~-对照组,另依CD25~+:CD25~-比例分设1:1组、1:5组、1:10组、1:20组,通过MTT比色试验检测CD4~+CD25~+Treg对CD4~+CD25~-T细胞抑制的细胞比例关系。⑤HMGB1刺激Treg 72h。刺激后细胞依CD25~+:CD25~-比例设1:1及1:5组。各组分设CD25~-组、未刺激Treg组及HMGB1-Treg组。通过MTT比色试验分析HMGB1刺激对Treg细胞抑制功能的影响。⑥SYBR GREEN法测定HMGB1刺激与Foxp3基因表达的时间、剂量-效应关系。⑦分别留取细胞培养上清,ELISA法测定不同细胞因子的变化情况。结果:1.小鼠CD4~+CD25~+Treg纯度分析:多次细胞分选实验证实,正常小鼠脾脏单个核细胞经过MACS两次分选后,CD4~+CD25~+T细胞纯度可达到91.74%～98.14%,其中CD25细胞低于3%;CD4~+CD25~-T细胞纯度达88.73%～93.85%,其中CD25~+细胞少于1%。所获得的CD4~+CD25~+T细胞经台盼蓝检测活性大于97%。2.PHA对于CD4~+CD25~+Treg细胞无明显活化作用,CTLA-4及Foxp3表达与对照组比较平均荧光强度没有明显差异(P＞0.05)。而Con A刺激Treg CTLA-4的表达上调呈一过性,作用持续时间不超过48 h,且对于Foxp3的表达也无明显的影响。抗-CD3则能够较好地活化Treg,表现为CTLA-4及Foxp3表达在24～72 h均明显增强(P＜0.05或P＜0.01),其中24、48 h表达上调更为明显(P＜0.01),并可延续至刺激后72 h。3.HMGB1刺激Treg,CTLA-4表达在24～72 h均有所下降(P＜0.05或P＜0.01),其中以作用48、72h表达下调尤为明显(P＜0.01);而不同剂量HMGB1(10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml)刺激均可诱导CTLA-4表达下降(P＜0.05或P＜0.01),其中HMGB1浓度在1000ng/ml时其表达减弱最明显。Foxp3表达与CTLA-4呈现出相同的趋势。细胞培养上清中IL-10水平呈现与HMGB1的剂量依赖关系,即HMGB1刺激浓度越高IL-10水平下降越明显。4.CD4~+CD25~-T细胞在活化后表现出增殖反应,但随Treg比例增加,CD4~+CD25~-T细胞增殖反应抑制。当细胞比例达到1:1时表现为对其抑制效应达到90%左右。当加入HMGB1(1000ng/ml)刺激的Treg时,CD4~+CD25~-T细胞增殖受抑程度减轻。这一现象在细胞比例为1:1及1:5组均表现出相同的趋势。5.经HMGB1刺激后的Treg Foxp3 mRNA表达分别于24～72h明显下调(P＜0.05或P＜0.01),其中以作用48、72h后表达下降尤为显著(P＜0.01);给予HMGB1刺激72 h后,10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的HMGB1刺激均可诱导Foxp3表达减弱(P＜0.0或P＜0.01),其中HMGB1的浓度在1000 ng/ml时Foxp3表达下调最明显。6.与正常对照组比较,不同时间及剂量HMGB1体外刺激Treg,其细胞培养上清中IL-2水平均无统计学差异(P＞0.05)。而细胞培养上清中IL-10水平随HMGB1刺激时间延长及浓度增高而下降明显(P＜0.05或P＜0.01)。将CD4~+CD25~-T细胞中加入Treg共培养后,CD4~+CD25~-T细胞上清中IL-2、IFN-γ水平明显下降,而当加入HMGB1刺激的Treg后,随HMGB1刺激浓度增加,二者生成受抑制的程度明显逆转(P＜0.05或P＜0.01)。与对照组相比,Treg组IL-4/IL-10生成明显增加,而HMGB1-Treg组IL-4/IL-10水平下降并有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01),且在HMGB1浓度为10ng/ml与100ng/ml时下降更为明显(P＜0.01)。结论:1.两步法免疫磁珠分离CD4~+CD25~+Treg细胞,所得细胞纯度高,细胞活力无影响,完全可以满足进一步实验的要求。2.在多种细胞刺激剂中,抗-CD3可以较好地活化Treg,为进一步实验提供了可能。3.HMGB1可能通过下调细胞表面抑制性分子的表达及抑制性细胞因子的分泌两条途径下调Treg的功能,而Foxp3基因及蛋白表达的一致性说明HMGB1是通过抑制关键基因Foxp3表达机制进而影响细胞免疫功能。4.HMGB1体外刺激不能改变Treg免疫无反应性,Treg介导了Th1向Th2的漂移,但HMGB1弱化了Treg诱导T淋巴细胞增殖、IL-2生成及功能性极化过程。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】