人类CTD磷酸酶UBCP1、Tim50L1及MCP1的克隆与功能研究

发布时间：2018-03-12 20:44

  本文选题：克隆　切入点：CTD磷酸酶　出处：《复旦大学》2005年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：RNA聚合酶Ⅱ是真核生物中负责转录结构基因的多亚基复合体,其最大亚基含有一个独特的羧基末端结构域(C-terminal domain,CTD),CTD的可逆磷酸化修饰在调控转录的起始、延伸、mRNA处理等活动中扮演重要角色。目前已确定的人CTD激酶有很多种,而CTD磷酸酶则只有FCP1、SCP1和PP1。 我们首先从人类胎脑cDNA文库以及多组织成人cDNA文库中克隆到4个可能的CTD磷酸酶基因UBCP1,Tim50L1,MCP1及DUH,它们编码的蛋白都含有与FCP1和SCP1相同的CTD磷酸酶催化结构域。UBCP1的cDNA全长2215bp,编码含318个氨基酸的蛋白。该基因定位在人类染色体5q33.3区域,含有11个外显子,跨度为22.7kb。UBCP1基因在各组织中的表达较广泛,在胎盘、肺、睾丸、卵巢组织中的表达量较高,而心、肝、肾、脾、直肠及外周血白细胞等组织的表达水平相对较低。EST分析、SAGE分析以及RT-PCR实验结果均一致地表明UBCP1在肿瘤组织中的表达水平显著上调,提示其与肿瘤具有相关性。原核表达的GST-UBCP1对磷酸酶通用底物pNPP具有磷酸酶活性,与FCP1和SCP1一样,其最适pH在5.0附近,且活性依赖于Mg~(2+)。定点突变分析确定了6个对UBCP1磷酸酶活性有关键作用的保守氨基酸以及4个重要位点,大多数位点在FCP1及SCP1中也是高度保守的。提示UBCP1与FCP1及SCP1在结构及催化机理上的一致性。UBCP1对CTD具有明显的去磷酸化作用,并且优先作用于CTD重复序列中的第5位Ser,表明它是一个新的人类CTD磷酸酶并具有位点偏好性。除了CTD磷酸酶结构域,UBCP1的N端具有一个泛素类似结构域(ubiquitin-like domain,UBLD),UBLD中含有一个蛋白酶体相互作用基序(proteasome-interacting motif,PIM),提示UBCP1可能与蛋白酶体有相互作用。的确,我们通过酵母双杂交筛选到一个蛋白酶体的亚基HsN3,体外结合实验证明了UBCP1与HsN3相互作用的特异性,但UBLD对这种相互作用并不是必需的。绿荧光融合蛋白表达显示了UBCP1定位在细胞核内,并且UBLD对于UBCP1的入核有重要影响。在COS-7细胞中过表达UBCP1可导致细胞凋亡,提示过表达UBCP1抑制RNAPⅡ转录活性的可能性。 Tim50L1是Tim50的一个剪接体,它们的差异在于N端的不同,Tim50L1缺失了Tim50具有的信号肽及跨膜区,造成了细胞定位的显著差异,Tim50定位在线粒体膜上,而Tim50L1主要定位于细胞核。EST分析显示它有可能在某些肿瘤组织中特异表达。Tim50L1编码240个氨基酸,其磷酸酶性质与其他CTD磷酸酶有显著差异,它在pH4.5及8.0附近活性最高,最适离子是Mn~(2+),最适温度在60℃附近。Tim50L1也对磷酸化的CTD表现出明显的去磷酸化作用,说
[Abstract]:RNA polymerase 鈪，

本文编号：1603231