结核分枝杆菌耐受表面活性物质相关基因的筛选及功能研究

发布时间：2018-03-20 07:40

  本文选题：基因组文库　切入点：结核分枝杆菌　出处：《西南大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 结核分枝杆菌一直是威胁人类健康的主要病原微生物之一，其致病机理至今仍未完全明了。结核分枝杆菌通过呼吸道入侵人体肺部时，面临诸多不利因素的胁迫，如缺氧、低pH值、肺部表面活性物质等，其中，肺部表面活性物质参与了对病原微生物入侵的免疫应答，并且使细菌面临表面活性物质的胁迫。研究与此相关分子机制，不仅能了解结核分枝杆菌在体内存活的机理，而且为消灭它们提供新的线索。 1998年对结核分枝杆菌H37Rv和CDC1551菌株全基因组测序工作的完成，使得对这种病原微生物的研究上了一个新的台阶。但从全基因组序列分析中得到的4000多个基因中，有16％的基因功能完全未知。这些基因很可能关系到结核分枝杆菌对环境胁迫的应答，探索相关基因的功能，将为深入研究结核分枝杆菌的致病机理给出新的线索，进而为新药物的开发提供可能的靶点。 为研究结核分枝杆菌参与表面活性物质胁迫的相关基因，提取结核分枝杆菌临床分离耐药菌株580的基因组DNA，以限制性内切酶消化后，在大肠杆菌JM109中构建结核分枝杆菌基因组文库，通过IPTG诱导获得结核基因在大肠杆菌中的功能性表达，进一步通过一系列梯度浓度的SDS的筛选，从中分离出含有结核分枝杆菌基因Rv0621的克隆S1。S1可以在空质粒对照不能生长的SDS选择性平板上生长。又因为肺部的表面活性物质与阴离子去垢剂SDS在物理性质上的相似性，从而推测结核分枝杆菌Rv0621基因编码的蛋白在抵御表面活性物质胁迫中有相关作用。 基因Rv0621编码一个37kDa的蛋白，经疏水性分析，推测为含有四个跨膜区的跨膜蛋白。并具有ATP/GTP结合位点的保守结构域。作为膜蛋白，推测该分子在结核菌生存，繁殖致病方面有重要的功能。因为就普遍而言，膜蛋白是一类与生物膜相互作用、具有重要功能和独特结构的蛋白质。结核分枝杆菌作为一种广泛关注的病原微生物，其膜蛋白的研究具有重要意义。结核分枝杆菌的细胞被膜有独特的分子组成和结构，介导该菌的胞内寄生，参与宿主的免疫应答，并通过屏蔽或外排药物导致该菌的耐药性。研究它们的结构和功能为了 解结核分枝杆菌的感染机理以及治疗结核病提供重要线索。同时，结核分枝杆菌的膜蛋白具有一定的代表性，它不仅有与原核生物中功能保守的膜蛋白，还有某些真核生物类似的膜蛋白，如真核样的腺苷酸环化酶，真核样G蛋白等；所有已知的脂质、聚酮代谢途径在分枝杆菌中都能找到，结核分枝杆菌中脂质、聚酮合成酶中，有很多是超出已知的范围，研究它们还有可能获得新的脂质聚酮合成途径。 通过序列比对发现，Rv0621编码蛋白同其它任何蛋白的序列同源性均不高，所以无法通过信息学的方法推断其功能。从其序列的特异性以及其结构的特点推断，该蛋白有可能成为诊断、治疗或者预防结核分枝杆菌引发的疾病的有价值的分子。 依据序列测定结果，从GenBank登录的结核分枝杆菌H37Rv Rv0621基因序列，设计引物，从H37Rv的基因组中扩增出基因Rv0621，并将其连入质粒pET32a(+)，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得该基因的融合表达产物。通过亲和纯化得到重组蛋白纯品。用原二色谱以及生物信息学模型分析该蛋白的二级结构，得到该蛋白的α螺旋、β折叠以及无规则卷曲的含量分别是16.38％，24.58％和59.04％。 通过GC-MS对重组菌和空质粒对照菌脂肪酸分析，我们发现，重组大肠杆菌的油酸(C18△9)的相对含量比空质粒对照高。文献显示，大肠杆菌在20℃时，油酸含量很低。而结核分枝杆菌中油酸的含量相对大肠杆菌是很高的。重组菌和空质粒对照大肠杆菌的这种差异显示该基因的重组表达产物对重组菌的脂肪酸组成产生一定的影响。因此推测，它在结核分枝杆菌基因组中的功能可能与该菌的脂肪酸代谢相关。 将重组菌和对照菌上清，纯化的重组蛋白处理肺癌细胞A549之后，细胞的形态有一定的改变，推测重组蛋白与细胞可能有相互作用，对细胞产生影响。 从试验结果推测，Rv0621编码的蛋白是一个有意义的分子，，在结核分枝杆菌的生理，毒理方面都可能有作用。对其继续的研究可能揭示很多以前未知的关于这种致病菌的详细信息，为我们最终战胜结核病提供新的思路。
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本文编号：1638114