人类GITR基因的克隆表达及其相关功能的初步研究

发布时间：2018-03-25 09:36

  本文选题：GITR　切入点：原核表达　出处：《江苏大学》2007年硕士论文

【摘要】： 目的：克隆人类糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(human glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，hGITR)基因，原核表达并纯化hGITR胞外段融合蛋白；制备针对hGITR胞外段融合蛋白的兔源性多抗并加以鉴定，并探讨该多抗对CD4~+T细胞增殖能力的影响。为进一步研究人类GITR/GITRL的分子作用机制奠定基础。 方法： 1)采用RT-PCR方法，从正常人外周血单个核细胞获得hGITR基因的cDNA，克隆至pGEM-T载体，转化E.coli DH5α宿主菌，行蓝白斑筛选，挑取白色菌落进一步行酶切以及PCR鉴定，将初步确定的阳性克隆测序鉴定。 2)以PCR方法从阳性TA克隆中获得hGITR胞外段(hGITR_(aa27-165))基因，连接至pQE30质粒，转化E.coli JM109宿主菌，选择阳性株，抽提质粒，进行BamHI、HindⅢ双酶切及PCR鉴定。 3)以阳性重组质粒pQE30-hGITR_(aa27-165)转化E.coli M15宿主菌，通过酶切、PCR鉴定阳性菌株。接种阳性菌于3ml氨苄抗性的LB培养基，37℃，250rpm，12～16小时，，以1/100的比例接种新鲜LB培养基，培养至OD600≈0.6时，分别加入终浓度为0.5、0.75、1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，分别在25℃、30℃、37℃继续振摇培养，0,2,4,6,8小时分别取菌液离心收集细菌，通过SDS-PAGE电泳鉴定表达蛋白，确定最适IPTG浓度、诱导温度和诱导时间，将所表达的hGITR_(aa27-165)融合蛋白用Profinity IMAC Ni-Charged Resin亲和层析柱分离纯化，纯化后蛋白经SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定。 4)将hGITR_(aa27-165)融合蛋白与弗氏佐剂充分乳化后，免疫家兔，制备抗hGITR胞外段抗血清，并以Protein A Sepharose柱纯化、交叉吸附去除非特异性抗体，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测其效价，Western Blot及流式细胞术(flow cytometry,FCM)鉴定多克隆抗体特异性，以多克隆抗体刺激CD4~+T细胞，通过~3H-TdR掺入法检测CD4~+T细胞的增殖状况。 结果： 1)成功构建pGEM-T-GITR载体。测序结果显示连接至pGEM-T载体的目的片段—hGITR基因，编码区cDNA的全长726bp，编码241个氨基酸残基，与GenBank中发表的序列完全一致。2)成功构建pQE30-hGITR_(aa27-165)原核表达重组质粒。PCR及BamHI、HindⅢ双酶切后，均可见417bp目的条带，测序结果通过Pubmed Blast发现与GenBank中的序列一致。确定终浓度0.5mmol/L IPTG，温度30℃，诱导时间6h为最佳诱导条件，通过Profinity IMAC Ni-Charged Resin亲和层析柱纯化目的蛋白，获得原核表达的hGITR_(aa27-165)融合蛋白，大小约为15.6KD。 3)免疫家兔获得抗hGITR_(aa27-165)融合蛋白多克隆抗体。抗体经纯化处理后ELISA检测效价为1:1.6×10~5，Western Blot与FCM检测显示其具有较好反应性和特异性，并且该多抗可以增强CD4~+T细胞的增殖能力。 结论：成功构建pGEM-T-hGITR载体并获得原核表达的hGITR_(aa27-165)融合蛋白，制备抗hGITR_(aa27-165)融合蛋白多克隆抗体，初步试验研究发现抗hGITR_(aa27-165)融合蛋白多克隆抗体对CD4~+T细胞具有促增殖作用。为进一步研究GITR/GITRL相互作用的分子机制打下基础。
[Abstract]:Objective: to clone human glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor (human glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor, hGITR) gene, prokaryotic expression and purification of hGITR ectodomain fusion protein; preparation for rabbit derived hGITR ectodomain fusion protein against and identified, and discuss the effect of antibody on CD4~+T cells the proliferation ability. Lay the foundation for further research the molecular mechanism of human GITR/GITRL.
Method锛

本文编号：1662548