抗SARS病毒人源Fab抗体的制备研究

发布时间：2018-03-27 12:03

  本文选题：SARS病毒　切入点：噬菌体表面展示　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2005年博士论文

【摘要】：SARS冠状病毒引起的严重呼吸系统综合症,具有很高的传染性和致死率,目前尚无特异性预防及治疗药物,研究抗SARS病毒人源抗体被动免疫,将有助于对SARS病人的救治。 目前噬菌体抗体库技术已成为人源抗体制备的强有力工具,它易于操作,筛选容量大,有利于获得一些稀有抗体,并可直接获得完全人源的单克隆抗体。本研究工作可分为4个部分:抗体库的构建、抗体库的富集及特异性单克隆抗体的筛选、中和抗体MlA的可溶性表达及纯化、MlA抗体活性的定量分析。 一、噬菌体抗体库的构建 建立人抗SARS病毒Fab抗体基因库的淋巴细胞来源于恢复期SARS患者的外周血,免疫荧光及体外中和试验检测抗SARS病毒抗体的滴度≥1:256及1:64,这为建立可能筛选出高亲和力的抗体基因库创造了条件。提取淋巴细胞RNA,利用RT-PCR方法克隆出7条重链Fd段抗体基因和9条轻链抗体基因,依次将轻链基因混合物和重链基因混合物酶切后连入载体pComb3内,构建成人源Fab分子噬菌体表面呈现文库,库容约2×10~6。 二、抗体库的富集及特异性单克隆抗体的筛选 目前大量研究结果表明,SARS病毒的4个主要结构蛋白中,S蛋白的主要功能是通过特异受体介导病毒与靶细胞结合,引起细胞融合,它是宿主免疫应答的重要靶位。从抗体库中筛选抗SARS病毒中和抗体,以S蛋白作为筛选靶标,对抗体库进行了富集筛选,经过4轮的“吸附结合-洗脱-扩增”过程,富集了抗S蛋白噬菌体抗体库。 人源单克隆抗体的筛选分为两个过程,结合特异性和中和活性的筛选。首先确立了可靠的双抗体夹心ELISA方法检测抗S蛋白特异性抗体。从50株随机挑取的Fab抗体克隆中筛选出12株抗S蛋白特异性抗体,然后测定其对SARS病毒的中和活性,筛选到一株抗体,有明显的抗SARS病毒中和活性,可推迟细胞病变的发生,编号为MlA;基因测序分析表明MlA抗体的轻链为V_k 3a家族基因,重链为V_H3家族基因。
[Abstract]:Severe respiratory syndrome (SARS) caused by SARS coronavirus is highly infectious and fatal. So far there are no specific drugs for prevention and treatment. The study of passive immunization against human antibodies against SARS virus will be helpful to the treatment of SARS patients. At present, phage antibody library technology has become a powerful tool for the preparation of human antibody, it is easy to operate, screening capacity is large, and it is helpful to obtain some rare antibodies. The work can be divided into four parts: the construction of antibody library, the enrichment of antibody library and the screening of specific monoclonal antibody. Soluble expression of neutralizing antibody MlA and quantitative analysis of purified MlA antibody activity. Construction of phage antibody library. Lymphocytes derived from the peripheral blood of convalescent SARS patients established the human anti-virus Fab antibody gene bank. Immunofluorescence and neutralization test in vitro were used to detect the titers of antibodies against SARS virus 鈮，

本文编号：1671443