Alpha-黑素细胞刺激素及其类似物对高迁移率族蛋白1及其受体表达的调控作用

发布时间：2018-04-01 01:28

本文选题：高迁移率族蛋白B1　切入点：晚期糖基化终末产物受体　出处：《第二军医大学》2007年硕士论文

【摘要】： 高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box-l, HMGB1)是一种DNA结合蛋白,因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳时的快速迁移而得名,是迄今为止所发现的唯一的能在细胞外诱导细胞因子和活化炎症细胞的核内蛋白。HMGB1具有3个结构域,即A、B、C区,A和B区主要构成HMGB1的非特异性DNA结合区;C区可与其它蛋白相互作用来调节HMGB1与DNA的亲和力。HMGB1分布十分广泛,在多种器官组织(如淋巴组织、脑、肝、肺、心、脾、肾等)的细胞中均有表达,而其表达水平又与细胞分化程度相关,未分化细胞的表达水平较高。作为危险信号和炎症介质,HMGB1的产生较TNF-α和IL-1等早期细胞因子晚,且持续时间较长,故有“晚期炎症介质”之称,它通过两种不同的途径释放至细胞外:活化炎症细胞的主动分泌和坏死细胞的被动释放。越来越多的文献报道,HMGB1是引起急性炎症反应的重要因素,HMGB1也可在胞浆内表达或分泌到细胞外,与脓毒症、肺动脉高压、肺炎症损伤、内毒素血症、关节炎、滑膜炎等疾病的发生密切相关。因此,寻找针对HMGB1的抑制剂,而有效的降低炎症的致死率,是本课题的要解决的重要问题。与HMGB1结合的高亲和力的配体是晚期糖基化终末产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE),RAGE是在内皮细胞中发现的,属免疫球蛋白超家族成员,由400多个氨基酸组成,相对分子质量约35 000,分为胞外段、跨膜段和胞内段。其胞外部分包含了一个“V”型区和两个“C”型区,与HMGB1结合的主要部位位于N端的“V”型区。RAGE广泛分布于单核/巨噬细胞、血管内皮细胞、肾系膜细胞、神经细胞及平滑肌细胞等细胞表面,与HMGB1结合以后会出现上调表达,启动一个正反馈环,产生多种细胞因子、对某些干细胞产生趋化作用、诱导血管粘附分子产生,使细胞持续处于激活状态,最终导致组织损伤。 α-黑素细胞刺激素(alpha-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)是一种内源性神经内分泌免疫调节肽,通过结合黑皮质素受体(Melanocortin Receptor MCR)来发挥退热、抗炎和免疫调节作用。实验证明α-MSH对一些早期致炎因子起到了一定的抑制作用,但由于其对MC1-R和MC3-R有较高的选择性,对MC4-R和MC5-R的亲和力很低,而不能高效、持久、稳定地发挥作用。虽然[Nle4,D-Phe7]α-MSH(NDP-MSH)是目前较为理想的α-MSH类似物,具备了高效、作用持续时间长、蛋白水解酶抵抗性强、稳定性高、可溶性好等优点,抗炎效果也优于α-MSH,但也是由于其受体的选择性不高,并且还有明显的色素沉着作用,有可能影响其它生理功能,故临床应用受到限制。本实验应用的α-黑素细胞刺激素新型类似物——多肽39是基因工程、蛋白质工程与化学修饰相结合的新生产物,这种利用软件InsightⅡ对α-MSH结构进行修饰,合成新型的类似物不仅对受体(MC1-R和MC5-R)具有很强的选择性,而且对实验性内毒素休克有显著的保护作用,能有效的减少肺、心、肝、肾、脑等脏器的炎症反应,这些特性为此新型化合物的临床应用提供了一定的科学依据。本课题的创新点在于,第一、α-MSH对于HMGB1及其受体RAGE是否具有调控作用,未见有人报道,我们从基因、蛋白两个方面做了大量实验,证实α-MSH可下调HMGB1及RAGE的表达。第二、多肽39是根据α-MSH结构由本实验室自主合成的全新的多肽化合物。第三、经实验证实多肽39对HMGB1及其受体RAGE的下调作用强于α-MSH及NDP-MSH,有效的控制了炎症的发生。第一部分α-黑素细胞刺激素及其类似物对内毒素血症小鼠表达高迁移率族蛋白1及其受体的调控作用首先对HMGB1及其受体RAGE在内毒素血症小鼠模型中的动态表达情况进行了检测,将BALB/c小鼠随机分成4组(A～D组),每组9只,A组为PBS对照组,其余3组参考Galanos的方法,小鼠腹腔内注射(ip)LPS(25μg/kg)和D-Gal(100 mg/kg)(PBS稀释)建立内毒素血症小鼠模型,分别于18 h(B组)、24 h(C组)、32 h(D组)后,取脑、肺、肝、肾、脾等组织,采用RT-PCR和Western Blot方法从基因和蛋白水平检测了HMGB1及其受体RAGE的表达情况。结果显示:HMGB1及其受体RAGE均在(ip)LPS 18 h有所表达,24 h表达到高峰,32 h HMGB1的表达量仍维持在较高水平,而RAGE的表达量在32 h明显减少,与对照组相比较有统计学差异(P0.01),并且HMGB1及其受体RAGE在肺、肝的表达量远高于其它组织。在此基础上,本实验又观察了α-MSH及其类似物NDP-MSH和多肽39调控HMGB1及其受体RAGE表达的时效关系。运用已建立的内毒素血症小鼠模型,按照给药时间不同,将BALB/c小鼠随机分成5组(A～E组),每组9只,A组为PBS对照组,B组为LPS对照组,C组、D组、E组小鼠分别在(ip) LPS后1 h、2 h、3 h注射2.5 mg/kg的三种多肽,24 h后处死小鼠,取肺、肝等组织,应用RT-PCR和Western Blot的方法鉴定。结果显示:在注射LPS后2 h之内分别给予三种多肽,能明显抑制HMGB1和RAGE的表达,与对照组相比较有统计学差异(P0.01)。α-MSH使HMGB1及其受体RAGE的表达量减少35%～40%,NDP-MSH使HMGB1及其受体RAGE的表达水平下降55%～60%,多肽39可使HMGB1的产生降低60%～65%,作用优于α-MSH和NDP-MSH。第二部分α-黑素细胞刺激素及其类似物在体外对U937细胞表达高迁移率族蛋白1及其受体的调控作用用含有10%小牛血清的1640培养基,在37℃,5%CO2的条件下培养人单核细胞系U937细胞。观察体外培养的U937细胞经LPS刺激后表达HMGB1及其受体RAGE的动态变化。根据收集细胞的时间不同,将其分为5组,用100 ng/ml LPS刺激U937细胞,分4个时间段(6 h, 12 h, 18 h, 24 h)收集细胞,提取蛋白和mRNA,应用Western blot和RT-PCR的方法测定HMGB1和RAGE的表达。结果显示:100ng/ml LPS刺激U937细胞18 h HMGB1表达到高峰,其受体RAGE表达高峰期早于HMGB1,但在18 h仍能维持较高水平,与对照组相比有统计学差异(P0.01),故我们选择18 h做为后续实验的最优时间点。在此基础上,对α-MSH及类似物调控U937细胞表达HMGB1及其受体RAGE的时效关系进行了检测。将U937细胞接种于24孔板,按照给药时间不同,分为5组(A～E组),A组为PBS对照组,B组为LPS对照组, C组、D组、E组为100ng/ml LPS刺激1 h、2 h、3 h后分别将浓度为10-7M的三种多肽加入到培养体系中,18 h后收集细胞进行检测。结果显示:细胞经100 ng/ml LPS刺激后,于2 h之内给药,HMGB1及其受体RAGE的表达量明显减少,并且与α-MSH、NDP-MSH相比,多肽39的抑制作用更强(P0.05),与体内实验的结果基本一致。另外,本实验观察了α-MSH及类似物对U937细胞表达HMGB1及其受体RAGE表达调控的量效关系。将U937细胞接种于24孔板,依据三个浓度梯度(10-5M、10-7M、10-9M)将细胞分成五组(A～E组),A组为空白对照组,B组为LPS对照组,C组、D组、E组用100 ng/ml LPS刺激细胞1 h内将10-5M、10-7M、10-9M三种浓度的三种多肽分别加入到培养体系中,18 h后收集细胞,运用Western blot和RT-PCR的方法从基因、蛋白两个水平进行检测。结果显示:10-5M、10-7M的多肽39和NDP-MSH能有效下调HMGB1及其受体RAGE的表达,而α-MSH在10-7M时作用效果比较理想。目前HMGB1与RAGE结合诱导细胞内的信号转导主要涉及两条通路。一条涉及Rac和Cdc42途径,导致细胞骨架重建;另一条涉及Ras-MAPK途径和随后核因子NF-κB移位介导的炎症反应。另有实验显示,抑制HMGB1与RAGE的相互作用能阻断p44/p42、p38、SAP/JNK MAPK和NF-κB活化。HMGB1介导的平滑肌移位能使MAPK途径激活且使磷酸化的ERK1和ERK2移位到细胞核。因此,我们结合LPS影响的信号途径选择其中二个重要的相关信号分子,即p38及NF-κB,初步探索α-MSH及其两个类似物对HMGB1与RAGE涉及的信号通路的调节作用。Western blot的结果显示,α-MSH及相关类似物明显抑制了p38的表达。另外,三种多肽对LPS诱导的NF-κB的表达也有显著的下调作用。本研究结果展示了HMGB1-RAGE信号途径与LPS信号途径之间存在交互作用,对进一步认识机体的炎症反应机制及其精细调控,以及新型治疗手段的发现提供了潜在新思路。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R341

【共引文献】