结核Rv1246c-Rv1247c基因重组耻垢分枝杆菌及其编码蛋白功能的初步研究

发布时间：2018-04-01 08:15

本文选题：结核分枝杆菌　切入点：持留状态　出处：《四川大学》2007年博士论文

【摘要】： 结核病是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一种慢性传染病，已困扰人类数千年。尽管目前的正规联合治疗方案(DOTS)取得良好的效果，但与其他感染性疾病相比，该病的治疗存在病程迁延、易复发的问题。资料表明全球大约有1/3的人口具有结核分枝杆菌的潜伏感染，随着社会老龄化、HIV感染和耐药菌株的流行，这一问题日渐突出，成为人类防治结核病的重要“瓶颈问题”。结核分枝杆菌的持留状态或称持留菌(Mycobacterial tuberculosis persister)被认为是结核病病程迁延、复发的根本原因。因此，探索MTB长期持留的分子机制，寻找抗结核潜伏感染的有效途径将为人类战胜结核病带来新的希望。目前关于结核分枝杆菌持留状态的分子生物学机制众说纷纭。近年在原核生物染色体基因组上广泛存在被认为参与原核生物基因表达质量控制的TA系统(Toxin-antitoxin model)可能与细菌在压力因素下的长期存活密切相关。Gerdes等通过比较基因组学方法发现在结核杆菌H37Rv株中含有38个TA loci，其中包括3个relBE位点。但关于这些基因在结核分枝杆菌中的生物学意义国内外鲜见报道。因此对这些未知功能的假想蛋白基因进行研究不仅对结核分枝杆菌后基因组学的研究增添实验资料，而且可能对深入认识、理解结核杆菌持留状态的分子生物机制提供新的研究方向。本研究在文献资料和生物信息学分析的基础上以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，首次对结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c基因进行克隆和融合表达，并构建了pMV-relBE(含Rv1246c-Rv1247c重叠基因)大肠杆菌—分枝杆菌重组表达穿梭质粒，用电穿孔方法将该质粒导入快速生长型非致病性耻垢分枝杆菌mc~2155株，并对该重组菌在体外压力环境和巨噬细胞内的存活情况及对巨噬细胞功能影响进行实验研究，初步探索目的基因在菌体存活、繁殖速率以及抵抗体内外环境压力等方面的功能；同时利用酵母双杂交系统，在酵母细胞体内观察Rv1246c-Rv1247c基因编码假想蛋白间的相互作用，为研究该对基因是否具有TA系统抗毒素—毒素通用模式提供实验依据。以重组耻垢分枝杆菌MCBE(负载Rv1246c-Rv1247c重叠基因)和MC261(负载pMV261空质粒)为实验对象，在体外营养丰富，培养条件适宜的环境下监测细菌的生长曲线，表明二者增殖特性相似，外源基因在该条件下不影响正常耻垢分枝杆菌的生长。在与上述相同培养条件下分别施加不同时间的热压力(53℃)和酸压力(pH 4.0)，通过对不同压力时间处理后细菌CFU(克隆形成单位)变化的统计分析，，推测结核Rv1246c-Rv1247c基因具有在体外压力环境中使菌体增殖延缓、通过调整菌体生长代谢状态以对抗环境压力的分子功能。感染小鼠ANA-1巨噬细胞的实验表明：与对照组相比较，负载Rv1246c-Rv1247c重叠基因的重组耻垢分枝杆菌MCBE感染巨噬细胞后其胞内繁殖速度较缓慢，且表现为触发感染细胞凋亡的能力较弱及刺激细胞明显活化反应相对迟缓的现象。酵母双杂交实验表明结核Rv1246c和Rv1247c基因编码的假想蛋白在酵母细胞内可以相互作用，推测二者具有TA系统抗毒素—毒素蛋白共同的胞内天然复合体形式。综上所述，本研究从生物信息学角度推测结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c基因编码的假想蛋白属于原核生物TA系统relBE家族；构建能够表达Rv1246c和Rv1247c基因编码假想保守蛋白的重组耻垢分枝杆菌能较对照组更易对抗体内外压力及抵御小鼠巨噬细胞活化、凋亡等作用，酵母双杂交系统明确二者具有胞内相互作用的功能，初步证实结核分枝杆菌Rv1246c-Rv1247c基因具有TA系统relBE家族压力反应元件的功能，在国内外尚属首次报道。本研究为研究结核分枝杆菌基因组TA系统的功能提供重要的实验资料，为探索结核杆菌菌体持留状态的分子机制提供了新的研究思路。
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【学位授予单位】：四川大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R52;R378

【参考文献】