阴道毛滴虫Rab1基因的克隆表达及其蛋白质的细胞内定位

发布时间：2018-04-14 06:18

  本文选题：阴道毛滴虫 + TvRab1鸟苷碱磷酸酶　； 参考：《汕头大学》2006年硕士论文

【摘要】：研究目的 (1)克隆和分析原生动物阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)两个Rab1鸟苷三磷酸酶(Guanosine Triphosphate，GTP)同源基因：TvRab1a和TvRab1-like；构建pQE80L／TvRab1a和pQE80L／TvRab1-like原核表达重组质粒并表达融合蛋白。(2)对这两个TvRab1蛋白进行阴道毛滴虫细胞内定位，初步确定其功能。 材料与方法 (1)从阴道毛滴虫构建的cDNA表达文库中分离出两个TvRab1的同源基因，测序并对其序列保守结构域进行同源性分析。用PCR方法扩增基因组DNA，并进行测序及序列分析。(2)将两段目的基因分别克隆至原核表达载体pQE80L中，并转化大肠杆菌E．coli M15感受态细胞，在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)诱导下表达目的基因融合蛋白；Ni-NTA亲和层析纯化表达产物，SDS-PAGE鉴定表达产物的分子量及纯化效果。(3)用纯化并复性的融合蛋白分别免疫豚鼠，获得重组蛋白抗血清；采用Western blot法对抗体特异性进行分析鉴定。(4)利用所得抗体进行免疫荧光细胞化学实验，对TvRab1a及TvRab1-like蛋白进行阴道毛滴虫原虫细胞内定位。 结果 (1)在已构建的cDNA文库中发现2个Rab1鸟苷三磷酸酶同源基因。其中1个cDNA序列长707碱基对，读码框含606对碱基，推测蛋白质序列含有202个氨基酸。序列分析表明该氨基酸序列与Rab1a蛋白亚家族的同源性最高，我们将其命名为TvRab1a。另一cDNA序列长717对碱基，读码框含603对碱基，推测蛋白质序列具200个氨基酸。序列比对分析显示该氨基酸序列与Rab1a蛋白有较高的同源性，我们将其命名为TvRab1-like。两氨基酸序列都拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域、特异性RabF结构域和典型的异戊烯化结构域。进化树分析提示毛滴虫的这两个基因系Rab1a的同源基因，在进化上它们更接近Rab1亚家族。以基因组DNA为模板扩增这两段序列并与其以cDNA序列进行比较发现这两个基因均含有一段25bp的内含子。(2)成功构建pQE80L／TvRab1a和pQE80L／TvRab1-like原核表达重组质粒，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE凝胶电泳分析显示，表达重组质粒分别在宿主菌大肠杆菌M15内表达出预期大小的重组蛋白质。(3)经Ni-NTA亲和柱纯化并复性的两个重组蛋白分别免疫豚鼠，，获得了
[Abstract]:Objective 1) to clone and analyze two homologous genes of Rab1 guanosine triphosphate triphosphatase (Rab1) from Trichomonas vaginalisis, a protozoan trichomonas vaginalis.To construct recombinant plasmids expressing pQE80L/TvRab1a and pQE80L/TvRab1-like prokaryotic expression and express fusion protein.Intracellular localization of Trichomonas vaginalis,Its function is preliminarily determined.Materials and methods two homologous genes of TvRab1 were isolated from the cDNA expression library constructed by Trichomonas vaginalis.The genomic DNA was amplified by PCR and sequenced and sequenced. The two target genes were cloned into prokaryotic expression vector pQE80L and transformed into E. coli E.coli M15 competent cells.Induced by isopropylthio- 尾 -D-galactoside IPTG (isopropylthio- 尾 -D-galactoside), the fusion protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography and purified by SDS-PAGE.The antiserum of recombinant protein was obtained, and the specificity of the antibody was identified by Western blot method. The antibody was used to carry out immunofluorescence cytochemical experiments to localize TvRab1a and TvRab1-like proteins in Trichomonas vaginalis protozoa.Results 1) two Rab1 guanosine triphosphatase homologous genes were found in the constructed cDNA library.One cDNA sequence was 707 base pairs long, and the reading frame contained 606 base pairs. The protein sequence was estimated to contain 202 amino acids.Sequence analysis showed that the amino acid sequence had the highest homology with Rab1a protein subfamily, and it was named TvRab1a.Another cDNA sequence was 717 pairs long, and the reading frame contained 603 pairs of bases, suggesting that the protein sequence had 200 amino acids.Sequence alignment analysis showed that the amino acid sequence had high homology with Rab1a protein, and we named it TvRab1-like.The two amino acid sequences have all conserved domains of Rab guanosine triphosphatase family, specific RabF domain and typical isopentenes domain.The phylogenetic tree analysis indicated that the homologous genes of the two lines of Trichomonas trichomonas Rab1a were closer to the Rab1 subfamily in evolution.Genomic DNA was used as template to amplify the two sequences and compared with their cDNA sequences. It was found that both of the two genes contained an intron of a segment of 25bp. PQE80L/TvRab1a and pQE80L/TvRab1-like prokaryotic expression plasmids were constructed successfully. The results of SDS-PAGE gel electrophoresis showed that the two genes were expressed in E. coli.Two recombinant proteins, which were purified by Ni-NTA affinity column and renatured by Ni-NTA affinity column, were expressed in the host strain E. coli M15, respectively. The recombinant proteins were obtained by immunizing guinea pigs.
【学位授予单位】：汕头大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R383

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本文编号：1748084