AGO2相互作用蛋白PSMC3、DFFA对RNAi功能的影响

发布时间：2018-04-15 05:19

  本文选题：RNAi + Argonaute2　； 参考：《天津医科大学》2007年硕士论文

【摘要】：目的： RNAi是生物体内基因转录后水平调节的重要方式。外源性的dsRNA.siRNA和内源性的miRNA均可以做作为RNAi的触发器,可以对同源靶RNA诱导产生强大且特异性的剪切或抑制表达作用。RISC作为RNAi的效应器,发挥静默mRNA的作用。人类Argonaute2蛋白是人类Argonaute蛋白家族中已知的唯一在RNAi起作用的成员,是RISC的核心成分之一,与siRNA即可构成最简单的效应器发挥剪切靶mRNA的作用。本实验室在前期工作中利用酵母双杂交系统从人类肺cDNA文库中筛选得到了一系列可能与人类Argonaute2蛋白PIWI(?)吉构域相互作用的蛋白,本文在前期工作的基础上选择了其中两个蛋白DFFA、 PSMC3进行深入研究,对其与Argonaute2蛋白的相互作用进行进一步验证,并研究了这两个蛋白对RNAi的影响,以期进一步深入了解RNAi的机制、探索RNAi可能的调控机制,为RNAi在临床上的应用提供理论依据。 方法： 选择本实验室在前期工作中利用酵母双杂交系统从人类肺cDNA文库中筛选得到的可能与人类Argonaute2蛋白PIWI结构域相互作用的两个蛋白DFFA、 PSMC3,利用免疫荧光技术,观察DFFA、PSMC3与AGO2蛋白在A549细胞内的共定位。通过分别转染DFFA.PSMC3表达质粒和特异性siRNA干扰DFFA、 PSMC3的表达来研究在活细胞内这两个蛋白对RNAi的影响。通过体外转录生成靶mRNA,利用细胞提取物来实现对靶nRNA的体外剪切,研究在细胞外这两个蛋白对RNAi的影响。 结果： 1.免疫荧光证明DFFA、PSMC3与内源性、外源性转染的AGO2蛋白共定位于细胞浆中。 2. DFFA.PSMC3的过表达在siRNA量为100nM时对RNAi的影响不明显,DFFA、PSMC3的过表达在siRNA量为50nM时对RNAi有促进作用,用特异性siRNA干扰DFFA、PSMC3的表达可以抑制RNAi的效果。 3.通过体外剪切靶mRNA,证实了DFFA、PSMC3的过表达对RNAi的影响不明显,特异性siRNA干扰DFFA、PSMC3的表达可以抑制RNAi的效果。 结论： 免疫荧光技术证实了细胞内DFFA、PSMC3与AG02蛋白存在共同定位,DFFA、PSMC3可以通过与AG02的相互作用影响RNAi、DFFA、PSMC3的过表达在siRNA饱和时对RNAi的影响不明显,DFFA、PSMC3的过表达在siRNA不饱和时可以促进RNAi的效果,DFFA、PSMC3的低表达可以抑制RNAi的效果。DFFA可能作为AG02蛋白的伴侣分子存在,参与AG02蛋白功能的正确发挥。PSMC3作为一种ATPase,兼有解旋酶的活性,则可能在RNAi过程中为siRNA的解旋提供能量,同时作为26S蛋白酶体的一部分,也有可能参与基因翻译起始后抑制。这两个与AG02蛋白相互作用蛋白的发现为RNAi调控机制提出了一种新的可能机制。
[Abstract]:Objective:RNAi is an important way to regulate gene posttranscriptional level in vivo.Exogenous dsRNA.siRNA and endogenous miRNA can both be used as triggers for RNAi, and can produce strong and specific splicing or inhibiting expression of RNA induced by homologous target. RISC acts as the effector of RNAi and plays the role of silent mRNA.Human Argonaute2 protein is the only known member of the human Argonaute protein family that functions in RNAi and is one of the core components of RISC. It can be used as the simplest effector to play the role of shearing target mRNA with siRNA.A series of human lung cDNA libraries were screened by yeast two-hybrid system in our laboratory. A series of possible connections with human Argonaute2 protein PIWII were obtained.Based on the previous work, two of the proteins, DFFA, PSMC3, were selected to further study the interaction with Argonaute2 protein, and the effects of these two proteins on RNAi were also studied.In order to further understand the mechanism of RNAi, explore the possible regulatory mechanism of RNAi, and provide a theoretical basis for the clinical application of RNAi.Methods:Two proteins, DFFA and PSMC3, which may interact with the PIWI domain of human Argonaute2 protein, were selected from human lung cDNA library by yeast two-hybrid system in our laboratory.The co-localization of DFFAP PSMC3 and AGO2 protein in A549 cells was observed.The effect of these two proteins on RNAi in living cells was studied by transfection of DFFA.PSMC3 expression plasmid and interference of PSMC3 and PSMC3 by specific siRNA.Target mRNAs were transcribed in vitro and the extracellular extracts were used to cut the target nRNA in vitro. The effects of these two proteins on RNAi were studied.Results:1.Immunofluorescence showed that DFFA-PSMC3 was co-located in cytoplasm with endogenous and exogenous AGO2 protein.2.The overexpression of DFFA.PSMC3 had no significant effect on RNAi when the amount of siRNA was 100nM. The overexpression of DFFA-PSMC3 could promote RNAi when the amount of siRNA was 50nM, and the effect of RNAi could be inhibited by the interference of siRNA with the expression of PSMC3 of DFFA-PSMC3.3.It was proved by cutting target mRNAs in vitro that the overexpression of DFFA-PSMC3 had no obvious effect on RNAi, and that the specific siRNA interference of DFFA-PSMC3 could inhibit the expression of RNAi.Conclusion:Immunofluorescence technique confirmed that the co-localization of DFFA-PSMC3 and AG02 protein in cells could influence the overexpression of DFFA-PSMC3 through the interaction with AG02. The over-expression of DFFA-PSMC3 was not obvious when siRNA was saturated. The overexpression of DFFA-PSMC3 could be promoted by siRNA unsaturated.Low expression of RNAi / PSMC3 inhibits the effect of RNAi. DFFA may be a chaperone of AG02 protein.Taking part in the proper function of AG02 protein .PSMC3, as a kind of Paseate, which has the activity of helicase, may provide energy for the unwinding of siRNA during the process of RNAi, as a part of 26s proteasome, and may also participate in the inhibition of gene translation after initiation.The discovery of these two interacting proteins with AG02 protein provides a new possible mechanism for the regulation of RNAi.
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R3416

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