近红外核壳荧光纳米颗粒的生化分析应用及新型压电免疫传感器研究

发布时间：2018-04-19 11:09

  本文选题：近红外荧光 + 核壳荧光纳米颗粒　； 参考：《湖南大学》2007年博士论文

【摘要】： 染料掺杂荧光纳米颗粒相对于量子点、荧光染料和等离子体共振颗粒而言具有诸如高量子产率、光稳定性、亲水性及易于使各种功能团在其表面修饰等显著的优点,所以近年来关于染料掺杂荧光纳米颗粒的研究报道时有增加,也引起了众多研究者的关注。但目前几乎所有的研究报道都集中于那些在可见区域激发的染料的包埋,这些染料掺杂的荧光纳米颗粒易于受自身荧光或细胞和体内测量的内滤效应的影响,从而限制了荧光纳米颗粒在生物分析、生物医学领域的进一步应用。相对于常规荧光检测而言,在近红外光区的荧光检测,生物基体光吸收或荧光强度很小,且致密介质(如组织)的光散射明显降低,激发光的穿透性更强,因而自发荧光的背景干扰显著降低,可以高灵敏和选择性地检测复杂生物分子及活细胞中的特定成分。而且,由于全血在近红外区域具有很弱的吸收,所以有望发展一种基于近红外荧光纳米颗粒对全血样品无需分离的直接检测方法。本论文前半部份报告有关近红外核壳荧光纳米颗粒的生化分析应用研究结果。针对目前荧光纳米颗粒的研究现状,发展了一种新型近红外核壳荧光纳米颗粒,并将其进行生物标记应用于全血样品中肿瘤标志物、白血病细胞及单碱基突变的直接检测。此外,利用纳米金的凝集变色效应,尚建立了一种新的等温滚环扩增反应的单碱基突变检测方法。主要内容如下: (1)基于一种改进的合成方法制备了新型近红外核壳荧光纳米颗粒。通过引入疏水性的硅醇盐作为纳米粒子内核,接着在油包水的微乳液中通过氨水催化正硅酸乙酯水解形成一层亲水的硅外壳,合成了核壳型的亚甲基兰掺杂荧光纳米颗粒,并对纳米颗粒的合成条件进行了优化。这种纳米颗粒的荧光明显强于用常规方法合成的纳米颗粒,且纳米颗粒的光稳定性明显增强,在水中几乎没有染料泄漏。纳米颗粒呈均匀的圆球型,大小一致,直径大约为65 nm。由于荧光分子在硅基质中得到了很好的保护,从而可免于被环境所污染。同时,基于近红外荧光的特性构建了一种新型近红外荧光纳米粒子的荧光各向异性免疫凝集分析方法,用于直接检测全血样品中的肿瘤标记物——甲胎蛋白(AFP),而不需经过分离步骤。结果表明,近红外荧光纳米探针在这种复杂的生物体系中不受背景的干扰,因此可以快速进行全血样品中AFP的直接检测。 (2)结合cell-SELEX技术筛选得到能特异性识别人急性淋巴白血病细胞的核酸适体的高特异性和核壳型近红外荧光纳米颗粒的优点,发展了一种能快速实现全血样品中肿瘤细胞的识别新技术,该方法简便、快速、灵敏,可望用于癌症的早期诊断、治疗方案的选择及预后的判断。 (3)结合运用连接酶反应和核壳型荧光纳米颗粒,提出了一种基于荧光各向异性技术与DNA连接酶的高保真性的检测方法,用于单碱基突变的直接检测。该方法使用一个等位特异的识别探针和一个普通的探针,这两条探针都标记在荧光纳米颗粒的表面。当这两条DNA探针与目标链发生杂交反应时,就引起荧光纳米颗粒的凝集,从而引起荧光探针的荧光各向异性值的增加。当识别探针3’端的碱基与目标链完全匹配时,DNA连接酶就会把这两条探针之间的缺口封闭,反之,当识别探针3’端的碱基与目标链不匹配时,缺口就不能被封闭。对于不匹配的情况,当加热解链形成的双链时,凝集的荧光纳米颗粒就会彼此分开,溶液的荧光各向异性值将恢复到初始值;而对于完全匹配的情况,溶液的荧光各向异性值仍保持纳米粒子团聚后的值。因此,通过灵敏的荧光各向异性检测就能很好地实现单碱基突变的检测。用该方法对结肠癌k-ras基因的第12位密码子的突变情况进行了检测,使突变型和野生型得到了很好的区分。 (4)结合本实验室在基因单碱基突变检测技术方面已有的研究成果,利用核酸修饰纳米金的这一凝集变色特性,提出了一种新的等温滚环扩增反应的检测方法,并用于人β地中海贫血基因-28位点的点突变灵敏定量检测。该方法能够区分突变的杂合子或纯合子,为DNA目标链单碱基突变的临床医学诊断提供了一种新的途径。 本论文的余下部分报告有关新型压电免疫传感器的研究成果。针对当前免疫传感器传感界面构建研究中存在的问题,在实验室原有工作的基础上,以压电石英晶体微天平为换能器,结合自组装膜技术、纳米生物修饰技术及聚电解质吸附组装技术,设计了一系列免疫活性材料固定化新方法,以期提高压电免疫传感技术用于临床实际诊断的可行性。同时,由于压电石英晶体微天平很难实现对小分子物质的直接检测,所以利用大分子亲和素与生物素之间的亲和力,设计了一种石英晶体微天平实现对小分子生物素的检测的方法。 (5)结合电聚合膜和纳米金自组装技术,提出了一种新的生物分子固定化方法,研制成一种检测抗胰蛋白酶的压电免疫传感器。通过在石英晶振金电极表面电聚合邻苯二胺膜,再在膜表面自组装一层纳米金粒,以静电吸附作用固定抗体(抗原),实现对相应抗原(抗体)的检测。利用扫描电镜技术,从形态上考察了晶振金电极上自组装纳米金后的表面形貌。考察了抗体的固定化条件,探讨了传感器的响应与再生性能。结果表明,这种固定化方法对所固定的生物分子的生物活性影响小,传感器的测定灵敏度高,响应性能和再生性能较好。 (6)基于Nafion膜界面构建了一种石英晶体微天平免疫传感器,用于血清中补体C4的检测。Nafion膜界面的表面形貌通过扫描电子显微镜进行表征。考察了抗体静电吸附过程,抗体固定的最佳条件以及免疫反应过程,所构建的免疫传感器测定补体C4的线性浓度范围为0.08-1.6μg/mL,检测相对标准偏差低于5.3%。该传感器制作简便,也易于使用后再生。 (7)通过带相反电荷聚电解质可交替吸附的自组装技术,研制了一种新型的生物传感界面。在压电石英晶体微天平(QCM)的金电极表面,修饰巯基乙酸(MAA)自组装单层膜(SAM)和带相反电荷聚电解质的多层自组装膜。然后将具有双面胶功能的带正电荷的壳聚糖分子连接带负电荷的褐藻酸钠-HSA抗体分子到负电性的MAA-SAM层。并实时考察了传感界面的组装过程和组装条件,运用原子力显微镜(AFM)考察了每层组装膜的表面形貌。与传统的抗体直接固定方法相比,本文提出的新型免疫传感技术能很好地保持抗体的活性,使灵敏度显著提高,也使传感器检测的线性范围明显变宽。尤其这种传感器具有简便而快速的再生性能。因此这种新的生物传感界面,在开发新的生物传感器件上具有潜在的优势。 (8)结合自组装技术和聚电解质间的静电吸附作用,在石英晶振的金电极表面构建了半胱胺自组装膜和壳聚糖/褐藻酸钠相反电荷聚电解质的多层自组装膜的传感界面,研制成一种检测人血清中B因子的压电免疫传感器。考察了标记抗体的固定化条件,探讨了传感器的响应与再生性能。与戊二醛共价交联固定方法相比较,这种优化的固定化方法所获得的传感器响应的频移值大,检测限低,检测范围宽,灵敏度高,传感器能够简便地实现再生。而且这种固定化方法有利于传感器上所固定的蛋白质分子的生物活性的保持。特异性实验和回收率结果表明,该传感系统可发展成临床检测B因子的一种有效工具。 (9)提出了一种新型的石英晶体微天平生物传感器用于小分子生物素的测定,该传感器是基于巯基化合物在金基底上稳固的混合自组装单层膜以及生物素和生物素类似化合物HABA与亲和素之间生物亲和力的不同。亲和素与固定于电极表面的HABA形成一种亚稳态分子复合物,当该传感器接触到包含生物素的样品溶液时,亚稳态分子复合物中的亲和素由于与溶液中生物素形成更为稳定的复合物而被拉离传感器表面,从而引起晶振频率的变化。该频率的变化与脱落的亲和素量成一定的比例关系,而且与溶液中生物素的浓度成一种明确的数学关系。传感器的制备过程中,混合自组装单层膜一方面有利于生物分子在电极表面的牢稳固定,另一方面,由于混合自组装单层膜较长的空间“手臂”更有利于俘获生物分子,有效提高了生物分子的固定量。实验证明,本章提出的生物传感器对浓度范围在0.017  1.67μg/mL的小分子生物素有很好的响应,而且该传感器的再生非常简单方便。
[Abstract]:In the light of the present situation of fluorescence detection in near infrared region , it is hopeful to develop a novel method for direct detection of fluorescent nanoparticles in whole blood .





A novel near - infrared core - shell fluorescent nanoparticle is prepared by introducing hydrophobic silanol salt as the inner core of nanoparticles , and then hydrolyzing ethyl orthosilicate through ammonia water to form a hydrophilic silicon shell in the microemulsion of oil - in - water .





( 2 ) combining cell - SELEX technology screening to obtain the high specificity and the core - shell type near - infrared fluorescent nanoparticle capable of specifically recognizing human acute lymphoblastic leukemia cells , and developing a novel technology for rapidly realizing the identification of tumor cells in whole blood samples , and the method is simple , rapid and sensitive , and can be used for early diagnosis of cancer , selection of treatment regimens and judgment of prognosis .





when the base of the recognition probe 3 ' is hybridized with the target chain , the fluorescence anisotropy value of the fluorescent probe can not be closed .





( 4 ) Based on the research results of this laboratory in the detection of single base mutation of gene , a new method of isothermal rolling ring amplification reaction is proposed , which can be used for the sensitive quantitative detection of the point mutation in human 尾 - thalassaemia gene - 28 locus . This method can distinguish the heterozygous or homozygotes of the mutation , and provide a new way for clinical medicine diagnosis of single base mutation of DNA target chain .





In order to improve the feasibility of using piezoelectric quartz crystal microbalance as transducer and self - assembly membrane technology , nano biological modification technology and polyelectrolyte adsorption assembly technology , a series of new immobilization methods of immunoactive material have been designed .





( 5 ) In combination with electropolymerization membrane and nano - gold self - assembly technology , a new immobilized method of biomolecule immobilization was proposed . A layer of nano gold particles were assembled on the surface of quartz crystal vibrating gold electrode . The surface morphology of the self - assembled monolayer of gold nanoparticles was investigated by means of scanning electron microscope . The results showed that the immobilized method had little influence on the biological activity of the immobilized biological molecules .





( 6 ) A quartz crystal microbalance immunosensor was constructed on the basis of the membrane interface . The surface morphology of the interface was characterized by scanning electron microscope . The optimal conditions of antibody static adsorption and antibody immobilization were investigated . The concentration range of complement C4 was 0.08 - 1.6 渭g / mL , and the relative standard deviation was lower than 5.3 % .





( 7 ) A new type of biosensing interface was developed by the self - assembly technique of alternating adsorption with oppositely charged polyelectrolyte . The self - assembled monolayer film ( SAM ) and multi - layer self - assembly film with opposite charge polyelectrolyte were prepared on the surface of gold electrode of piezoelectric quartz crystal microbalance ( QCM ) .





( 8 ) Based on the electrostatic adsorption between self - assembly technology and polyelectrolyte , a kind of self - assembled monolayer self - assembly membrane with self - assembly membrane and chitosan / sodium alginate was constructed on the surface of gold electrode of quartz crystal oscillator . The immobilized conditions of labeled antibody were studied . The immobilized method was used to detect the biological activity of protein molecules immobilized on the sensor . The results showed that the sensor system could be developed into a useful tool for clinical detection of B factor .





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本文编号：1772847