猪内源性逆转录病毒分子特性的研究及抗病毒位点的选择

发布时间：2018-04-28 01:24

本文选题：异种移植 + 人兽共患疾病　；参考：《四川大学》2007年博士论文

【摘要】： 供器官严重不足是目前困扰移植界的重要难题之一。供器官短缺可从以下几方面进行探索：(1)宣传和发展自体移植，如自体骨髓／外周血细胞移植；(2)扩大同种异体供器官来源，如宣传脑死亡立法，放宽对供者年龄的限制和倡导活体亲属供器官等；(3)人工器官／组织工程材料；(4)克隆技术／胚胎干细胞技术；(5)研究开发异种供器官源。近年来，组织工程和胚胎干细胞的研究发展非常迅速并成为医学界关注的焦点，但其临床应用优势主要集中于创伤修复，而且相关研究仍处于早期阶段，体内外条件下能否诱导胚胎干细胞分化发育为实体器官尚无确切证据证实。因此，异种器官的开发和选择仍是解决供器官短缺的重要途径之一。以前曾一度认为灵长类动物因其亲缘关系与人类最近，会成为最佳的异种器官供源，但由于灵长类动物属濒危物种，数目稀少，难以大量用于临床移植，更重要的是灵长类动物体内的病原体有使移植受者感染致病的危险，现已证实人免疫缺陷病毒(HIV)源自非洲绿猴，因此已将灵长类动物作为异种供器官源的可能性排除。目前猪被公认为是最佳的异种供器官源。因猪的器官在形态学及解剖学上与人的器官相似，且在猪-人肝肾功能的匹配研究中也发现猪肝脏合成α、β球蛋白的能力与人相近，表明猪器官是具有人类器官相应生理功能的成熟器官。对猪-人异种组织的移植已经进行了部分尝试，如猪胰岛细胞治疗糖尿病；猪皮治疗烧伤病人；猪神经干细胞治疗帕金森症，及猪骨治疗骨折病人等。在猪-人移植的临床研究中，虽然猪与人器官功能基本匹配，但仍有两个主要障碍尚需攻克。一是排斥，因猪-人移植属于远缘移植，除同种异体移植常见的排斥反应外，还有超急性排斥，但随着转人CD55转基因猪的出现及新型免疫抑制剂的开发和使用，，排斥反应得到了较好的控制；二是人兽共患病，即猪体内的病原体可通过移植传染给受者，进而传播到健康人群，造成灾难性后果。猪体内存在着多种病原体，如布鲁杆菌、钩端螺旋体菌、疱疹病毒、马脑炎病毒、球孢子菌、锥虫菌、血吸虫，以及近两年引起人们高度重视的使人致病的猪链球菌，这些病原体都可能在移植后感染受者并致病，随着现代动物饲养技术的提高，已可饲养出无病原体或无特定病原体(SPF)的猪，同时也可在移植前通过筛查去除猪器官中的病原体。但猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retroviruses，PERV)是整合在猪的基因组中，并能以孟德尔遗传方式传给后代的一种病毒，因此无法通过上述常规方式去除。 PERV为典型的哺乳动物C型逆转录病毒，具有gag，pol，env三个功能基因和3’，5’端长的末端重复序列结构(Long Terminal Repeat，LTR)。PERV以“前病毒”DNA的形式整合在其宿主——猪的细胞染色体中。PERV可分为γ(γ1～γ5)和β(β1～β4)两类，定量PCR结果表明PERV的拷贝数从2个(β2和γ5)到约50个(γ1)。其中γ1、γ2和β4在成体猪的肾组织中处于活化状态。野生型猪、旧世界猪(Suidae)和新世界猪(Tayassuidae)中仅发现一个逆转录亚群β2。γ1是已知具有感染力的亚群，其外壳蛋白基因(env)的SU区域的差异分为三种亚型，分别为PERV-A，PERV-B和PERV-C。PERV-A，-B可感染多种人源细胞及非人灵长类细胞，PERV-C仅感染特定猪来源的细胞。其他类型PERV还尚未证实有感染性。 PERV可在体外感染多种人源细胞系，如来源于T淋巴细胞、骨髓细胞、NK细胞及肾脏的细胞系。这种感染与细胞系的组织器官来源无关，而与这些细胞系的转化方式及体外培养状况相关。PERV在体外感染非人灵长类细胞的研究包括恒河猴肺部来源细胞(FRhL-2)、视网膜内皮细胞(RF／6A)和肾脏来源细胞(BSC-1)，原代细胞包括恒河猴来源的肺、肾、主动脉和脐静脉细胞。PERV可发生亚型间的重组，且感染力增强，增加了异种移植后发生种间感染的可能性。PERV还可作为诱导移植排斥的抗原，在猪到小鼠的皮肤移植模型中引发排斥反应。 PERV的体内感染性研究因缺乏理想的模型导致结果不尽相同，动物实验和临床研究结果并不一致，因此目前对PERV的体内感染性尚无确切结论，另外关于PERV致病性的相关研究尚无报道。临床回顾性研究中，发现无论是在猪到非人灵长类的移植模型中，还是在用猪胰岛治疗糖尿病、猪皮肤治疗烧伤病人、猪肝脏或肾脏搭桥进行体外灌注的研究中，均未找到PERV感染的证据。在动物模型的研究中，将猪的胰岛移植到免疫缺陷小鼠中，3个月后检测发现小鼠体内的多个组织均感染PERV。虽然在临床检测和动物模型研究中均未找到PERV体内感染的证据，但是这些研究仍存在一系列问题：一是所研究的个体中只有少数接受了免疫抑制；二是病人与猪细胞的体内接触时间有限，在PERV还未建立感染时即被清除；三是在研究中仅检测病人的外周血单个核细胞，未检测病人体内其他类型的细胞是否感染了PERV。目前尚不清楚PBMC表面是否存在PERV的感染受体，进一步研究仍是必要的。在本课题组以前的研究中，曾对来自中国三个地方的猪种共117头个体进行了PERV的流行病学调查，分离外周血白细胞进行检测，发现在这些中国猪种中无PERV缺失个体，在基因组中的拷贝数较高，而且检测到PERV的高表达。亚型分析中发现中国猪种的PERV以A，B亚型为主，且多数为A／B混合亚型，未发现C亚型的个体。对34头版纳微型猪近交系(BMI)的逆转录酶活性进行检测，发现RT活性在不同个体中有差异。目前国内外尚无关于猪不同组织的PERV拷贝数和亚型是否存在差异的研究报道。本研究第一部分中，分离并提取BMI不同组织的DNA，用PCR及Real-Time PCR方法对同一猪个体中不同组织的PERV拷贝及亚型进行研究，以寻找低拷贝甚至缺失PERV的组织及器官；同时分离12头BMI的外周血单个核细胞(PBMC)，用PHA及IL-2刺激72小时后进行致死性辐射，再与人源细胞系HEK293细胞共培养，以研究同一猪种不同个体对HEK293细胞的嗜性差异，并假设不同猪个体表达的PERV对同一种细胞会表现出不同的感染力及易感性。结果表明版纳微型猪近交系中，17种组织及器官的基因组DNA中均有PERV-gag、pol的嵌合，所检测的亚型均为A，B亚型，未检测到-C亚型的个体，定量PCR结果发现pol基因的拷贝数在不同组织中的差异较大(甲状腺：97.1；膀胱：1.4)，而gag、envA、envB在不同组织中的差异相对较小。应用细胞共培养的方法对12头BMI中的PERV的嗜性差异进行分析，发现来自BMI的PBMC经PHA及IL-2共刺激培养，并经过致死性辐射后，与人源肾脏细胞系293共培养，有6头BMI中的PERV可感染293细胞，另外6头的PERV未感染，证实同一猪种不同个体所表达的PERV会对同一种细胞表现出不同的嗜性及感染力。国外对PERV各功能基因的研究中，采用生物信息学软件LOHA_(TM)研究PERV-A 14／220时发现其是由PERV-C与PERV-A序列重组而来，该克隆gag，pol，envTM均来自PERV-C，而env的受体结合区域(RBD)来自PERV-A，该850bp区域包括受体区域，因此改变了其细胞嗜性。另外，还发现来自PERV-C的多个决定域可明显增加PERV-A 14／220的感染滴度。在PERV-NIH，PERV-C，PERV-A和PERV-B的长末端重复序列(LTR)的研究中表明PERV-A，-B相似性较大，而PERV-NIH和PERV-C的U3区域的差别较大。本课题组以前的研究中，曾研究了PERV体外长期感染HEK293细胞，检测发现人源HEK293细胞长期感染PERV后在细胞形态、细胞倍增时间、细胞凋亡率、DNA含量、DNA合成能力等方面未发生明显变化，但其细胞血清依赖性增强，提示在PERV长期感染人源细胞后未发现PERV导致的细胞病变。目前的研究尚未对中国猪种内PERV的各功能基因进行深入研究，本研究第二部分用PCR及基因克隆测序，并结合生物信息学方法，对来自中国三个猪种(版纳微型猪近交系、五指山猪、内江猪)中的PERV各功能基因(gag、pol和env)以及长末端重复序列(LTR)与其他已报道的PERV序列及部分具致病性的逆转录病毒(C型、D型逆转录病毒及慢病毒)进行了序列对比及同源进化分析，对中国猪种中PERV的可能致病性及感染力进行评估。gag和pol基因的研究结果，发现来自中国三个猪种的PERV与部分具有致病性的C型，D型逆转录病毒及慢病毒(HIV-1)有共同的同源结构域，并可找到两个高度匹配的结构域；env基因的研究也同样发现了与gag、pol一样的同源区域，该区域位于env基因的受体结构域，表明PERV与其他C型逆转录病毒在受体结合方面有一定的共同性；对这三个功能基因所构建的同源进化树研究中，发现中国猪种中的PERV与部分C型逆转录病毒有共同的同源进化关系；LTR研究发现BMI及WZSP中的LTR与PERV-A，-B有较高的同源性，但在序列的重复次数中存在差异，提示其感染力的差异，而NJP中的PERV-LTR与PERV-C的同源性较高。抗病毒的常规途径有两种：疫苗及药物。国外研究用11种已在FDA注册的用于HIV治疗的化学药物，其中包括6种抗核苷酶药物和5种蛋白酶抑制剂，在体外实验中研究这些药物对PERV的抗病毒作用，结果发现11种抗HIV药物中，仅齐多夫定有潜在的临床应用价值。另外的研究采用最新RNA干扰技术，对PERV在靶细胞中的表达进行抑制，表明该技术可用于以后的抗病毒治疗。本研究第三部分在此基础上，根据生物信息学所研究的同源区域，设计针对PERV功能基因gag、pol及LTR的小片段干扰RNA(siRNA)，用脂质体转染的方法导入高表达PERV的PK15细胞中，检测不同的siRNA对PERV表达抑制的效果，以寻找新的抗病毒位点。结果发现来自LTR的siRNA未起到抑制表达的作用，而来自gag、pol的G1，G2，P1，P2中，P2的表达抑制作用最强，G1只能起到微弱的抗感染作用，且抑制作用在转染后48小时最强，并且具有剂量依赖性。以上结果表明，在所检测的BMI各组织器官的基因组中均存在PERV各功能基因，对其拷贝数的研究证实各组织器官也无实质性差异，表明并无PERV缺失的组织或器官，提示在临床应用中，寻找无PERV的组织器官优先用于临床治疗是不现实的；生物信息学研究发现来自三个中国猪种的PERV的三个功能基因gag、pol、env与部分具有致病性的C型，D型逆转录病毒及慢病毒(HIV-1)存在一定的同源性，gag和pol的同源序列分别属于种群特异抗原和编码逆转录酶区域，表明PERV与C型逆转录病毒具有相似的种群抗原特异性，且PERV也可编码与这些病毒相似的逆转录酶；env序列研究中，PERV与其他逆转录病毒的同源序列位于受体结合区域，提示PERV与这些病毒在感染宿主细胞方面有很大的相似性；这些结果均表明即使尚未找到PERV致病的证据，但由于PERV的各功能基因与这些致病病毒的相似性，仍不能忽略PERV的潜在致病性，及PERV与其他病毒发生重组并发生变异的危险性。LTR研究发现同一猪种(BMI)的序列重复次数存在差异，说明同一猪种内的PERV存在感染力的强弱及嗜性的差异，该结果有助于在以后的临床研究应用中，选择体内PERV感染力较弱的个体用于临床治疗。RNA干扰实验证实了siRNA可在靶细胞中有效抑制PERV的表达，表明RNA干扰可用于PERV的表达控制，RNA干扰不仅可克服抗病毒药物所带来的副作用问题，最大的优点是可以靶向降低PERV的表达，而不会对宿主细胞内其他基因的正常表达产生影响。综上所述，本实验结果及本课题组以前的工作表明PERV虽可在体外感染多种人源细胞，但未发现PERV可引起其宿主细胞病变；国外的临床回顾性研究发现在用猪组织、细胞进行临床治疗，或用猪肝脏、肾脏的搭桥治疗中，均未找到PERV在体内感染的证据。但PERV的潜在致病性仍不能忽视，因病毒经常发生重组并改变原病毒的感染力及宿主范围，以后的工作应致力于研究PERV的重组特性，并进一步提高现有PERV感染性、致病性检测方法的敏感性及特异性，以达到控制并最终排除PERV所引起的跨种感染。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：四川大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R373;R617

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