人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体单链可变区片段噬菌体文库的初建

发布时间：2018-05-01 21:37

  本文选题：尖吻蝮蛇 + 蛇毒蛋白　； 参考：《中国生物制品学杂志》2014年01期

【摘要】：目的构建人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体单链可变区片段(scFv)噬菌体文库。方法采用Trizol试剂提取尖吻蝮蛇咬伤后恢复期患者的外周血淋巴细胞的总RNA,用Oligotex姈mRNA Mini Kits纯化获得总mRNA,逆转录合成总cDNA,针对人抗体轻链和重链可变区基因设计一系列特异性引物,以合成的总cDNA为模板,扩增得到抗体轻链和重链可变区基因库,再通过重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)将轻链和重链拼接得到scFv文库;将scFv基因双酶切后,插入T7噬菌体骨架进行包装,以尖吻蝮蛇蛇毒蛋白抗原进行4轮淘选,建立蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库,采用噬斑法检测scFv噬菌体文库滴度并进行PCR及测序鉴定。结果成功地将轻链和重链可变区基因库混合拼接得到scFv文库;经4轮淘选,蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库滴度为6.0×1014PFU/ml,抗体基因在噬菌体中表达的阳性率达50%以上,表达的scFv片段均为轻链和重链的杂合体,可较好的重现可变区的多样性。结论已成功构建了人源尖吻蝮蛇毒蛋白抗体scFv噬菌体文库,为下一步噬菌体文库的克隆构建和筛选奠定了基础。
[Abstract]:Objective to construct a phage library of human Agkistrodon acutus venom single chain variable region (scFv) antibody. Methods Trizol reagent was used to extract the total RNAs from the peripheral blood lymphocytes of the convalescent patients after bitten by Agkistrodon acutus. The total mRNAs were purified by Oligotex mRNA Mini Kits and synthesized by reverse transcription. A series of specific primers were designed for the genes of light chain and heavy chain variable region of human antibody. Using the synthesized total cDNA as template, the variable region gene library of light chain and heavy chain of antibody was amplified, then the light chain and heavy chain of scFv library were spliced by overlapping extension of PCR(splicing by overlap extension PCRnSOE-PCR.The scFv gene was digested by double enzyme and inserted into the framework of T7 phage for packaging. The scFv phage library of snake venom antibody (scFv) was established by four rounds of panning with Agkistrodon acutus snake venom protein antigen. The titer of scFv phage library was detected by plaque method and PCR and sequencing were carried out. Results the scFv library was successfully constructed by the combination of light chain and heavy chain variable region gene library, the titer of scFv phage library of snake venom antibody was 6.0 脳 10 14 PFU / ml, and the positive rate of antibody gene expression in phage was over 50%. The expressed scFv fragments were heterozygous of light chain and heavy chain, which could reproduce the diversity of variable region. Conclusion the scFv phage library of human Agkistrodon acutus venom antibody has been successfully constructed, which lays a foundation for the cloning and screening of the next phage library.
【作者单位】： 第三军医大学西南医院急救部;
【基金】：国家自然科学基金(81071537) 重庆市科技攻关项目(CSTC\2010AC5026) 第三军医大学临床创新基金(2009XLC15)资助
【分类号】：R392.1

【共引文献】

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本文编号：1831131